Methode M1
Ermittlung des Gesamtgehalts von Hydroxytyrosol und Tyrosol in Olivenöl, das für die Zwecke der gesundheitsbezogenen Angaben geeignet ist, mittels UHPLC
Die M1-Methode wurde im Rahmen der Projektaufgabe „Stärkung des Vertrauens der Verbraucher in die gesundheitlichen Eigenschaften von EVOOs: Entwicklung von Methoden zur Ermittlung phenolischer Verbindungen“ entwickelt. Es handelt sich dabei um die UHPLC-Ermittlung des Gesamtgehaltes an Hydroxytyrosol (Htyr) und Tyrosol (Tyr) in Olivenöl, die für die Zwecke der durch die EG-Verordnung 432/2012 für „Olivenölpolyphenole“ eingeführten gesundheitsbezogenen Angabe geeignet ist. Diese Ermittlung zielt darauf ab, den Gesamtgehalt an Hydroxytyrsol (Htyr) und Tyrosol (Tyr) in der polaren Fraktion von Olivenöl vor und nach der Säurehydrolyse ihrer gebundenen Formen zu quantifizieren. Dieser Gehalt kann mit kommerziell erhältlichen Standards genau quantifiziert werden und wird als Gesamthydroxytyrosol und -Tyrosol (mg/20 g Öl) nach der Korrektur der Molekulargewichtsunterschiede zwischen freier und gebundener Form ausgedrückt. Zur Beschleunigung der Analyse wurde die Methode UHPLC verwendet (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(6), 1044; https://doi.org/10.3390/molecules24061044).
Die M1-Methode, die in Abb. 1 grafisch dargestellt ist, wurde intern in Bezug auf Spezifität, Linearität, Präzision, Rückgewinnung und Robustheit validiert, einschließlich der LOD- und LOQ-Bestimmung der Zielanalyten. Das Extraktionsverfahren wurde jedoch nicht validiert, da es sich hierbei um das von IOC vorgeschlagene Extraktionsverfahren (COI/T.20/Doc. Nr. 29, 2009) ohne Zusatz des internen Standards handelte.
Abb. 1 Intern validiertes UHPLC-Protokoll, das für die Zwecke der gesundheitsbezogenen Angabe in Olivenölen geeignet ist
Die Ergebnisse der M1-Methode wurden anschließend mit denen der COI-Methode verglichen (Methode COI/T.20/DOC. 29/Rev. 1 - 2017, Bestimmung von Biophenolen in Olivenölen mittels HPLC), wie in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung aufgezeigt wurde (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(13), 2429; https://doi.org/10.3390/molecules24132429).
Gemäß den Verfahren des OLEUM-Projekts wurde die M1-Methode für eine vollständige Validierung ausgewählt, die in zwei Zyklen durchgeführt wird. An der Vorstudie nahmen zwischen September und Dezember 2019 dreizehn Laboratorien aus der EU, China, den USA und Australien teil. Die Teilnehmer haben zwei verschiedene Proben von extra nativem Olivenöl erhalten und wurden in Bezug drauf gebeten, diese nach einer von den Methodenentwicklern erstellten Standardarbeitsanweisung (SOP) zu analysieren. Die Teilnehmer hatten zudem die Möglichkeit, im Oktober 2019 in Sevilla an einem Workshop zum Fachwissensaustausch teilzunehmen. Bei diesem Workshop konnten sie Fragen stellten und Feedback zur Anwendung des Analyseprotokolls und insbesondere zu den Informationen der SOP geben.
Die Metadatenanalyse der Chromatogramme und der entsprechenden quantitativen Ergebnisse identifizierte den Vorgang der Hydrolyse als kritisch, falls die in der SOP beschriebenen Bedingungen nicht genau eingehalten werden. Die in der Vorversuchsstudie aufgeworfenen Schwachpunkte wurden in der überarbeiteten Fassung der SOP behandelt, die den Teilnehmern des Versuchsprozess zugesandt wurde. Darüber hinaus wird ein Audio-Video der M1-Methode mit Erläuterungen zu den Berechnungen anhand von Beispielen, das ebenfalls von den Entwicklern erstellt wurde, über OLEUM auf YouTube (https://www.youtube.com/watch?v=-nr45PnLnF4) veröffentlicht, um die Schulung der Interessenten zu erleichtern. Der Versuchsprozess findet momentan statt.
Für das Entwicklungsteam der Aristoteles-Universität M1
Maria Z Tsimidou (Professorin) und Nikolaos Nenadis (Assistenzprofessor)