Metodo M1

Determinazione mediante UHPLC del contenuto totale di idrossitirosolo e tirosolo nell'olio d'oliva in relazione all'indicazione salutistica
 

Il metodo M1 è stato sviluppato nell'ambito delle attività del task "Aumentare la fiducia del consumatore sulle proprietà salutistiche degli oli extra vergini di oliva (EVOO): sviluppo di metodi per la determinazione dei composti fenolici". Tale metodo si basa sulla determinazione mediante UHPLC del contenuto totale di idrossitirosolo (Htyr) e tirosolo (Tyr) nell'olio d'oliva in relazione all'indicazione salutistica introdotta dal regolamento (UE) 432/2012 riguardante i polifenoli dell'olio d'oliva. Questa determinazione mira a quantificare il contenuto totale di idrossitirosolo (Htyr) e tirosolo (Tyr) nella frazione polare dell'olio d'oliva prima e dopo l'idrolisi acida delle loro forme legate. Il contenuto totale di Htyr e Tyr, espresso in mg/20 g di olio, si può quantificare utilizzando standard disponibili in commercio. Per ottenere tale contenuto viene applicata una correzione basata sulle differenze di peso molecolare tra le forme libere e legate di Htyr e Tyr. L'UHPLC è stato utilizzato per velocizzare l'analisi (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(6), 1044; https://doi.org/10.3390/molecules24061044).

Lo schema del metodo M1 viene mostrato nella Fig. 1 sottostante. Il metodo è stato validato internamente per quanto riguarda la specificità, linearità, precisione, recupero e robustezza, compresa la determinazione dei LOD e LOQ degli analiti target. La procedura di estrazione non è stata validata ca differenza di quella proposta dal COI (Consiglio Oleicolo Internazionale) (COI/T.20/Doc. n. 29, 2009) senza l'aggiunta dello standard interno.

 

Fig. 1 Protocollo UHPLC validato internamente, adatto per l’indicazione sulla salute nell'olio d'oliva

I risultati del metodo M1 sono stati confrontati con quelli del metodo COI (Metodo COI/T.20/DOC. 29/Rev. 1 - 2017, Determinazione dei biofenoli negli oli d'oliva mediante il metodo HPLC) come indicato in una recente pubblicazione (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(13), 2429; https://doi.org/10.3390/molecules24132429).

Nell’ambito del progetto OLEUM, il metodo M1 è stato selezionato per essere sottoposto a validazione piena. Alla fase di pre-trial hanno partecipato, tra settembre e dicembre 2019, tredici laboratori provenienti da tutto il mondo (UE, Cina, Stati Uniti d’America ed Australia). I partecipanti hanno ricevuto due diversi campioni di olio vergine di oliva, i quali sono stati analizzati seguendo una procedura operativa standard (SOP - standard operation procedure) predisposta dagli sviluppatori del metodo. I partecipanti hanno anche avuto l'opportunità di partecipare ad un workshop di trasferimento di conoscenze nell'ottobre del 2019 a Siviglia. Nel corso di questo workshop hanno posto domande e fornito un feedback sull'applicazione del protocollo analitico e in particolare sulla SOP.

L'analisi dei dei cromatogrammi e dei rispettivi risultati quantitativi ha permesso di identificare la fase di idrolisi come critica se non vengono seguite le esatte condizioni descritte nella SOP. I punti deboli sollevati nella fase di pre-trial sono stati affrontati nella versione revisionata della SOP inviata ai partecipanti del processo. Inoltre, per facilitare la comprensione del metodo è stato caricato su YouTube un audio-video relativo al metodo M1 che include anche le spiegazioni sui calcoli tramite degli esempi presentati dagli sviluppatori del metodo (https://www.youtube.com/watch?v=-nr45PnLnF4). Le elaborazioni dei risultati dei trial proper sono, ad ora, in corso.

Per il team di sviluppo del metodo dell'Università Aristotele di Salonicco

Maria Z Tsimidou (Professoressa) e Nikolaos Nenadis (Professore assistente)