Mέθοδος M1
Προσδιορισμός της συνολικής περιεκτικότητας σε υδροξυτυροσόλη και τυροσόλη στο ελαιόλαδο για την υποστήριξη του ισχυρισμού υγείας με χρωματογραφία υπερυψηλής πίεσης [UHPLC]
Η μέθοδος M1 που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο της ενότητας εργασίας «Αυξάνοντας την εμπιστοσύνη των καταναλωτών ως προς τις ιδιότητες υγείας του EVOO: ανάπτυξη μεθόδων για τον προσδιορισμό των φαινολικών ενώσεων» είναι ο προσδιορισμός UHPLC (χρωματογραφία υπερυψηλής πίεσης) της συνολικής περιεκτικότητας σε υδροξυτυροσόλη και τυροσόλη στο ελαιόλαδο που είναι κατάλληλη για για την υποστήριξη του ισχυρισμού υγείας που εισήχθη με τον κανονισμού της ΕΕ 432/2012 για τις «πολυφαινόλες ελαιολάδου». Στοχεύει στην ποσοτικοποίηση της συνολικής περιεκτικότητας υδροξυτυρόλης (Htyr) και τυροσόλης (Tyr) στο πολικό κλάσμα του ελαιολάδου πριν και μετά την όξινη υδρόλυση των δεσμευμένων μορφών τους. Αυτή η περιεκτικότητα μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με ακρίβεια χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα πρότυπα και εκφράζεται ως ολική Htyr και Tyr (mg/20 g ελαίου) μετά από διόρθωση με κατάλληλους συντελεστές εξαιτίας της διαφοράς μοριακού βάρους μεταξύ ελεύθερων και δεσμευμένων μορφών. Η UHPLC έχει χρησιμοποιηθεί για να επιταχύνει την ανάλυση (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24 (6), 1044; https://doi.org/10.3390/molecules24061044).
Η μέθοδος Μ1 που απεικονίζεται γραφικά στο Σχ. 1 έχει επικυρωθεί ενδοεργαστηριακά όσον αφορά την ειδικότητα, τη γραμμικότητα, την πιστότητα, την ανάκτηση και την ανθεκτικότητα, συμπεριλαμβανομένου του προσδιορισμού του ορίου ανίχνευσης (LOD) και του ορίου ποσοτικοποίησης (LOQ) των ενώσεων-στόχων. Η διαδικασία εκχύλισης δεν επικυρώθηκε καθώς είναι αυτή που πρότεινε το ΔΣΕ (COI/T.20/Doc. No. 29, 2009), αλλά χωρίς την προσθήκη του εσωτερικού προτύπου.
Σχ. 1 Ενδοεργαστηριακά επικυρωμένο πρωτόκολλο UHPLC που είναι κατάλληλο για την την υποστήριξη του ισχυρισμού υγείας στο ελαιόλαδο
Τα αποτελέσματα της μεθόδου Μ1 έχουν συγκριθεί με αυτά που προέκυψαν από την εφαρμογή της μεθόδου του ΔΣΕ (Μέθοδος COI/T.20/DOC. 29/Rev. 1 – 2017, Προσδιορισμός των βιοφαινολών στα ελαιόλαδα με χρωματογραφία υψηλής πίεσης [HPLC]) όπως παρουσιάστηκε σε μια πρόσφατη δημοσίευση (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(13), 2429; https://doi.org/10.3390/molecules24132429).
Σύμφωνα με τις διαδικασίες του έργου OLEUM, η μέθοδος M1 επιλέχθηκε για πλήρη επικύρωση που πραγματοποιείται σε δύο κύκλους. Στην προ-δοκιμαστική μελέτη συμμετείχαν δεκατρία εργαστήρια από την ΕΕ, την Κίνα, τις ΗΠΑ και την Αυστραλία από τον Σεπτέμβριο
μέχρι τον Δεκέμβριο του 2019. Οι συμμετέχοντες έλαβαν δύο διαφορετικά δείγματα εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου και τους ζητήθηκε να τα αναλύσουν ακολουθώντας μια τυποποιημένη διαδικασία λειτουργίας (SOP) που προετοίμασαν οι ερευνητές που ανέπτυξαν την μέθοδο. Οι συμμετέχοντες είχαν επίσης την ευκαιρία να παρακολουθήσουν ένα εκπαιδευτικό σεμινάριο μεταφοράς τεχνογνωσίας τον Οκτώβριο του 2019 στη Σεβίλλη, κατά τη διάρκεια του οποίου έκαναν ερωτήσεις και εξέφρασαν τη γνώμη τους σχετικά με την εφαρμογή του αναλυτικού πρωτοκόλλου και ειδικότερα των πληροφοριών που περιλαμβάνονται στη SOP.
Η μέτα-ανάλυση των χρωματογραφημάτων και των αντίστοιχων ποσοτικών αποτελεσμάτων ανέδειξαν την κρισιμότητα του σταδίου της υδρόλυσης σε περίπτωση που δεν τηρούνται οι ακριβείς οδηγίες που δίνονται στη SOP. Τα αδύνατα σημεία που αναδείχθηκαν κατά την προ-δοκιμαστική μελέτη αντιμετωπίστηκαν στην αναθεωρημένη έκδοση της SOP που στάλθηκε στους συμμετέχοντες της τελικής δοκιμής αξιολόγησης. Επιπλέον, μέσω του OLEUM, είναι διαθέσιμο στο YouTube οπτικοακουστικό υλικό με περιγραφή της μεθόδου M1, που δημιουργήθηκε από τους επιστήμονες που την ανέπτυξαν και επιπλέον περιλαμβάνει επεξηγήσεις για τους υπολογισμούς μέσω παραδείγματος (https://www.youtube.com/watch?v=-nr45PnLnF4) για τη διευκόλυνση της εκπαίδευσης των ενδιαφερομένων μερών. Πλέον, συνεχίζεται το στάδιο της τελικής δοκιμής αξιολόγησης.
Για την ομάδα ανάπτυξης της μεθόδου Μ1 του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου
Μαρία Ζ. Τσιμίδου (Καθηγήτρια) και Νικόλαος Νενάδης (Επίκουρος Καθηγητής)