4. OLEUM analytische Lösungen für die Authentizität von Olivenöl

Dr. Alessandra Bendini hielt im Rahmen der Food Fraud Session - Part I Authenticity and Integrity, die während des EFFOST-Kongresses 2018 organisiert wurde, eine Rede über die Fortschritte des OLEUM-Projekts, das sich mit möglichen analytischen Lösungen für die Authentizität von Olivenöl befasst.

 

In Anbetracht der Notwendigkeit, die betrügerischen Geschäftspraktiken zu bekämpfen, die den Olivenölsektor belasten und das Vertrauen der Verbraucher und das positive Image der Olivenprodukte beeinträchtigen, spielt das Projekt OLEUM eine wichtige Rolle. Insbesondere zielt OLEUM darauf ab, zuverlässige analytische Lösungen zu entwickeln und zu validieren mit dem Ziel:

 

i) Überarbeitung der bestehenden offiziellen EU-Methoden um bestimmte Schritte von Analyseprotokollen zu ersetzen, um somit die Zeit für die Analyse und den Lösungsmittelverbrauch zu reduzieren.

ii) neue Verfahren zum Nachweis spezifischer Marker für spezifische Betrugsfälle durch zielgerichtete Analytik

iii) neue Screening-Methoden mit nicht-zielgerichteter Analytik

 

In diesem Rahmen wurden einige Beispiele für neue Analysestrategien zur Aufdeckung der drei häufigsten Fälle von Olivenölbetrug vorgestellt.

 

Insbesondere betrifft der erste Fall die Qualität, die nicht mit der angegebenen Qualität übereinstimmt, z.B. wenn ein natives oder im schlimmsten Fall ein Lampantöl als natives Olivenöl extra (EVOO) vermarktet wird, das die höchste Qualitätsstufe ist: eine zielgerichtete Methode zur Unterstützung des IOC-Panel-Tests (offizielle sensorische Methode) auf der Grundlage der Identifizierung und Quantifizierung einzelner flüchtiger Moleküle als Marker für sensorische Defekte wurde entwickelt und ihre Validierung ist in Arbeit (beteiligte Partner: CSIC, ITERG, NESTEC, UB, UNIBO, UNIPG, UNIUD). Dieser SPME-GC-FID/MS-Ansatz muss in der Lage sein, Proben nach ihren Qualitätsstufen zu unterscheiden und einfach genug sein, um von den offiziellen Kontrolllabors angewendet zu werden. Eine ähnliche Methode gibt es offiziell noch nicht. Um der Notwendigkeit Rechnung zu tragen, die tägliche Arbeit der Sensorikpanels von Olivenölunternehmen deutlich zu verringern, werden derzeit vier verschiedene, nicht zielgerichtete Schnellscreening-Methoden evaluiert (beteiligte Partner: EUROFINS, UB, UNIBO). Diese Methoden basieren auf einem Fingerprinting-Ansatz, d.h. einer chemometrischen Ausarbeitung des gesamten Profils in flüchtigen Molekülen ohne Schritte der Identifizierung und Quantifizierung. Das Ziel ist es, robuste Klassifizierungsmodelle zu entwickeln, die in der Lage sind, Proben anhand ihrer Qualitätsstufen zu unterscheiden. Aktuell wurden Klassifizierungsmodelle mit 180 Ölen erstellt, die im ersten Jahr der Probenahme gesammelt wurden (beteiligte Partner: EUROFINS, ITERG, IPTPO, UNIBO, UZZK, ZRS). Die vorläufigen Ergebnisse lieferten mehr als 85% korrekte Klassifizierung von EVOOs und Nicht-EVOOs. Bei der Betrachtung von Nicht-EVOOs wurden ähnliche Prozentsätze bei der Unterscheidung zwischen nativen und Lampant Olivenölen gefunden. Diese Klassifizierungsmodelle werden durch die Hinzufügung der anderen 154 Proben, die im zweiten Jahr der Stichprobenziehung gesammelt wurden (beteiligte Partner: EUROFINS, ITERG, IPTPO, UNIBO, UZZK, ZRS) voraussichtlich noch aussagekräftiger und besser.

 

Nach der EU-Verordnung dürfen native Olivenöle aus den Oliven ausschließlich durch mechanische oder physikalische Behandlungen unter Bedingungen gewonnen werden, die nicht zu einer Veränderung des Öls führen. Aus diesem Grund ist die Soft-Desodorierung eine illegale Praxis, wenn sie mit dem Ziel durchgeführt wird, die flüchtigen Verbindungen, die für negative Eigenschaften verantwortlich sind, zu verringern und auf diese Weise sensorische Mängel bei minderwertigen Olivenölen zu beseitigen. Dieses sanft desodorierte Öl wird dann mit einem Prozentsatz von EVOO gemischt und die Mischung wird betrügerisch als EVOO vermarktet. Die Soft-Desodorierung, die bei niedrigen Temperaturen durchgeführt wird, entfernt jedoch nicht die im Öl verbleibenden Fettsäure-Ethylester (FAEEs). FAEEs werden in gelagerten Oliven gebildet durch die Reaktion zwischen freien Fettsäuren, die durch enzymatische Hydrolyse von Triacylglyceriden (TGs) erzeugt werden, und Ethanol, das durch die mikrobielle Zuckerfermentation entsteht. Aus diesem Grund sind FAEEs Marker für minderwertige Öle und können auch als indirekte Marker für die Behandlung der sanften Desodorierung angesehen werden. Darauf aufbauend wurde 2011 eine offizielle Methode zur Bestimmung der Konzentration von FAEEs genehmigt und der gesetzliche Grenzwert für EVOO später geändert. Die offizielle Methode ist jedoch besonders zeitaufwändig und erfordert große Mengen an Lösungsmitteln. Angesichts dieser Nachteile wurden im OLEUM-Projekt zwei alternative Verfahren zur Beschleunigung und Mechanisierung der Analyse der FAEEs realisiert und intern validiert, mit dem Ziel, Verbesserungen am offiziellen Protokoll vorzuschlagen (durch CSIC und UNIBO). Im Rahmen des OLEUM-Projekts wurde eine sanfte Desodorierungsbehandlung durch Kurzwegdestillation auf verschiedene Arten von defekten nativen Olivenölen (von ITERG) angewendet. Anschließend wurden verschiedene Mischungen zwischen jedem sanft desodorierten Öl und EVOOs in verschiedenen Verhältnissen (von FERA) hergestellt und von den Partnern analysiert. Auf der Grundlage dieses Stichprobensets arbeiten die OLEUM-Partner an neuen analytischen Screening-Strategien zur Überprüfung der Konformität von EVOOs mit der gesetzlichen Grenze von FAEE (beteiligte Partner: CSIC, ITERG, UNIBO), aber auch zur Ermittlung möglicher neuer Marker für diese illegale Behandlung; insbesondere wurden neue rechtliche Parameter auf der Grundlage von freien Fettsäuren und Diacylglyceriden (DGs) vorläufig vorgeschlagen und deren Wirksamkeit wird derzeit bewertet (durch CSIC).

 

Der zweite Fall von häufigem Betrug betrifft die illegale und legale Mischung zwischen nativem Olivenöl extra oder Olivenöl und anderen billigeren Pflanzenölen. Gemäß der EU-Verordnung 29/2012 ist es möglich, in EU-Ländern (mit einigen nationalen Ausnahmen wie Spanien und Italien) legale Mischungen zwischen Olivenöl (OO) und pflanzlichen Ölen herzustellen und zu vermarkten. In diesem Fall darf das Vorhandensein von Olivenöl nur dann auf dem Etikett angegeben werden, wenn es mehr als 50% der Mischung ausmacht. Eine offizielle Methode zur Überprüfung der Richtigkeit dieser Angabe gibt es jedoch noch nicht. Um diesen möglichen Betrug zu bekämpfen, entwickeln die Forscher im OLEUM-Projekt (von CSIC) eine zielgerichtete Methode, die von den offiziellen Kontrolllabors angewendet werden kann. Diese neue Methode basiert auf der Ausarbeitung eines Entscheidungsbaums, der Mindestgehalte an spezifischen typischen Haupt- (TGs) und Nebenverbindungen (lineare aliphatische Kohlenwasserstoffe, Tocopherole, freie Sterole) von OO und EVOO festlegt.

 

Um Fremdöle in nativem Olivenöl extra und Olivenöl zu erkennen, berechnet die offizielle Methode einen spezifischen Parameter namens ECN 42. Diese gesetzliche Grenze basiert auf einer mathematischen Berechnung und das analytische Protokoll ist mühsam (lange Analysedauer, Verwendung großer Mengen von Lösungsmitteln) und weist einige Einschränkungen auf (geringe Auflösung spezifischer TGs). Ein alternativer analytischer Ansatz, insbesondere eine Schnellscreening-Methode, wird im Projekt OLEUM (von UB) untersucht. Dieser analytische Ansatz bietet viele Vorteile gegenüber dem offiziellen. Tatsächlich arbeitet das auf HESI-UHRMS basierende Gerät mit hoher Auflösung und Genauigkeit, die Analyse durch direkte Infusion ist sehr schnell (für jede Analyse werden nur 2 Minuten benötigt) und die Probenvorbereitung ist einfach. Verschiedene Arten von möglichen Verfälschungen von EVOO oder OO mit Pflanzenölen wurden betrachtet und eingeteilt, dadurch gekennzeichnet, dass i) ein hoher Gehalt an Ölsäure wie Haselnuss, Avocado und Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt sowohl in nativen als auch in raffinierten Typologien ii) ein Verfälschungsmittel mit hohem Linolsäuregehalt wie raffiniertes konventionelles Sonnenblumenöl und iii) ein Verfälschungsmittel mit hohem Palmitinsäuregehalt wie raffiniertes Palmöl verwendet wird. Für jedes dieser Verfälschungsmittel wurden drei verschiedene Prozentsätze (2, 5 und 10%) in EVOO und OO erstellt. Für diesen Ansatz ist die chemometrische Datenverarbeitung, bei der das TGs-Profil als Datenmatrix verwendet wird, unerlässlich. Die Ergebnisse, die für Verfälschungsmittele sowohl mit hohen Gehalten an Palmitinsäure als auch an Linolsäure erzielt wurden, bei dem die Verfälschungsmittel das raffinierte Palmöl und das raffinierte Sonnenblumenöl waren, die jeweils mit 2, 5 und 10 % in EVOO und OO gemischt waren, waren zufriedenstellend; tatsächlich wurden alle verfälschten Proben sowie die nicht verfälschten Proben korrekt klassifiziert. In Anbetracht des schwierigsten Falles im Zusammenhang mit dem Modell mit hohem Ölsäuregehalt, bei dem die Verfälschungsmittel die raffinierten und nativen Haselnussöle, die raffinierten und nativen Avocadoöle und die raffinierten und desterolierten Sonnenblumenöle mit hohem Ölsäuregehalt waren, ergab das Vorhersagemodell nur dann ein zufriedenstellendes Ergebnis, wenn das Verfälschungsmittel mit EVOO oder OO bei 5 und 10 % gemischt wurde, Gehalte von 2% konnten nicht erkannt werden.

 

Der dritte Fall von häufigem Betrug betrifft die Nichteinhaltung der geografischen Ursprungsbezeichnung. Im Allgemeinen richtet sich das Verhalten der Verbraucher beim Kauf von Lebensmitteln nach einer stärkeren Präferenz für diejenigen Produkte, deren geografische Herkunft angegeben wird, da diese Informationen ihr Vertrauen deutlich stärken. Gemäß der EU-Verordnung 29/2012 müssen EVOO und VOO die geografische Ursprungsbezeichnung auf dem Etikett tragen, und zwar nach den Sonderfällen, die sich auf den Ursprung in der EU oder außerhalb der EU beziehen und aus mehr als einem Mitgliedstaat oder Drittland stammen. Dennoch steht keine offizielle Methode (geteilt und validiert) zur Verfügung, um die Einhaltung der geografischen Herkunft zu überprüfen, die bisher nur durch dokumentierte Rückverfolgbarkeit nachgewiesen werden kann. Die Verfügbarkeit einer zuverlässigen und möglichst schnellen Methode zur Überprüfung des geografischen Ursprungs eines nativen Olivenöls ist eine dringende Notwendigkeit. Im Projekt OLEUM werden mehrere analytische Ansätze auf der Basis spektroskopischer und chromatographischer Analysen untersucht (beteiligte Partner: CONICET-EHU, CNRIFFI, EAF, EUROFINS, FERA, ITERG, SMART ASSAYS, UB, UNIBO, UNIPG, UNIUD). Eine der vielversprechendsten Methoden bewertet die semi-flüchtige Sesquiterpen-Kohlenwasserstofffraktion als Marker geografischen Ursprungs und bestimmt sie mit einem SPME-GC-MS-Gerät mit Ziel- und Nichtzielansatz (durch UB). Der nicht-zielgerichtete Ansatz, der das gesamte semi-flüchtige Profil als Fingerabdruck aufbereitet, ermöglicht eine viel bessere Unterscheidung als der zielgerichtete Ansatz. Darüber hinaus kann die Methode für die Routineanalytik vorgeschlagen werden, da diese Art von Instrument in Kontrolllabors allgemein verfügbar ist. Ein weiterer innovativer analytischer Ansatz für die Analyse der flüchtigen Verbindungen von nativen Olivenölen wurde ebenfalls entwickelt und basiert auf der Flash-Gaschromatographie-Analyse (von UNIBO). Der Hauptvorteil dieser Technik ist die kurze Analysezeit, tatsächlich sind nur 3 Minuten erforderlich, um das Profil der flüchtigen Verbindungen aufzunehmen. Eine chemometrische Ausarbeitung, die nicht-zielgerichtet auf die chromatographischen Spuren angewendet wurde, wurde realisiert. Bisher wurden 174 Proben mit dieser Methode analysiert, die sich durch unterschiedliche geografische Herkunft auszeichnen: aus einzelnen EU-Ländern, einzelnen Nicht-EU-Ländern und Mischungen von EU- und Nicht-EU-Ländern. Die aus dem Klassifikationsmodell gewonnenen Vorhersageergebnisse waren zufriedenstellend, tatsächlich ermöglichten die vollständige Kreuzvalidierung und die externe Validierung eine korrekte Klassifizierung von 98,5 bzw. 92,5 % für Nicht-EU-Proben, und 5 von 6 der Extra-EU-Blends wurden korrekt klassifiziert. In Anbetracht des breiteren Spektrums von EU-Ölen wurden auch die vollständige Kreuzvalidierung und die externe Validierung, die es erlaubte, die 86 bzw. 80% der Proben richtig zu klassifizieren, sowie 9 von 12 EU-Blends korrekt klassifiziert. Andere Proben müssen analysiert werden, um die zufriedenstellenden Ergebnisse zu überprüfen, insbesondere ist es notwendig, Nicht-EU-Proben hinzuzufügen, um ein besseres Gleichgewicht zwischen den beiden Probensätzen zu erreichen.

 

Alessandra Bendini (Università di Bologna, UNIBO), Stefania Vichi and Alba Tres (Universitat de Barcelona, UB), Wenceslao Moreda and Diego Luis García-González (Instituto de la Grasa, CSIC)