7th OLEUM Newsletter

6th OLEUM Newsletter

5th OLEUM Newsletter

4th OLEUM Newsletter

3rd OLEUM Newsletter

2nd OLEUM Newsletter

1st OLEUM Newsletter

Conferencia final del proyecto OLEUM

En 17 y 18 de febrero de 2021, el proyecto OLEUM celebró con éxito su conferencia final. En total, más de 400 personas de diferentes campos se inscribieron en la reunión en línea para conocer los resultados del proyecto y discutir las posibilidades futuras para asegurar la calidad y autenticidad del aceite de oliva.

El evento se dividió en dos días, el primer día se centró en los resultados y los impactos de OLEUM en el futuro de las políticas europeas sobre el aceite de oliva y el segundo día se centró en las herramientas y métodos analíticos recientemente desarrollados para garantizar aún más la calidad y autenticidad del aceite de oliva.

El profesor Giovanni Molari, Jefe del Departamento de Ciencias Agrícolas y Alimentarias de la Universidad de Bolonia, dio la bienvenida a los asistentes antes de que la coordinadora del proyecto, la Dra.Tullia Gallina Toschi, ofreciera un resumen de los resultados más importantes del proyecto OLEUM y afirmó que las oportunidades que surgen de ellos son de gran interés y de gran valor para el mercado. Los resultados que ofrece el proyecto OLEUM también se tienen en cuenta en el desarrollo de futuras políticas de aceite de oliva de la UE.

"Necesitamos tener un papel formativo sobre qué es el aceite de oliva y qué es el AOVE". - Prof. Dra. Tullia Gallina Toschi

La Red OLEUM, internacional y en continuo crecimiento, reúne y amplía la experiencia de alta calidad en el análisis y autenticación de aceites de oliva. De esta forma, conducen a nuevas e innovadoras herramientas y métodos para contrarrestar actividades fraudulentas y proteger la calidad del aceite de oliva. Los hallazgos de estos métodos se pueden almacenar en el banco de datos OLEUM, que es uno de los resultados clave del proyecto y ayuda a mejorar el intercambio de información entre las diferentes partes interesadas de la comunidad del aceite de oliva. Debido a la gran cantidad de información incorrecta sobre el aceite de oliva de diversas fuentes, es una parte importante del proyecto brindar información confiable y basada en la ciencia al público, por lo que la parte de comunicación del proyecto OLEUM es de gran importancia.

Los desarrolladores introdujeron y explicaron los métodos respectivos en el segundo día de la conferencia final de OLEUM. Los asistentes pudieron conocer los antecedentes técnicos y tuvieron la posibilidad de aclarar las preguntas de los desarrolladores en una sesión de preguntas y respuestas.

Los comentarios al final de la conferencia, así como en el chat y a través de las redes sociales, fueron excelentes y el equipo de OLEUM desea agradecer a todos los asistentes y oradores por hacer esto posible.

Para obtener más información sobre los principales resultados del proyecto, las grabaciones de la conferencia final y otros recursos, consulte el Paquete Virtual que preparamos para usted: Haga clic aquí

¡Puedes encontrar la grabación de la conferencia final aquí!

La Red OLEUM

Tassos Koidis, Paul Breton y Enrico Valli
 

Desde nuestra última comunicación, la Red OLEUM no ha dejado de crecer, tanto en contenido como en número de miembros. Ya somos 120 miembros en nuestra plataforma OLEUM Basecamp (un 18% más) y 164 miembros (un 21%) en OLEUM «Question of the Month», nuestra red de LinkedIn. Hemos publicado 3 preguntas y respuestas adicionales (P1: ¿Verdadero o falso? El calentamiento del aceite de oliva provoca la producción de ácidos grasos trans. Q2: ¿Qué es el aceite de repaso? Q3: ¿El AOVE prensado en frío es siempre superior al AOVE normal?). 

Ha sido un periodo muy ocupado para algunos de los miembros de OLEUM que han llevado a cabo los estudios de validación de métodos, que finalizaron justo antes de Navidad. Los miembros que trabajan en laboratorios de ensayo privados y públicos, como Jorge de Sovena, encontraron muy útil el hecho de poder acceder libremente al material de formación de los dos talleres de OLEUM que tuvieron lugar en España (19 de octubre) e Italia (19 de diciembre) desde los recursos de la Red OLEUM. Además, últimamente se han unido a la Red muchos nuevos estudiantes, como Gabriela, de la Universidad de Córdoba (España), que escribió: «Necesitaba información sobre el aceite de oliva para preparar mi TFG y, en especial, sobre la técnica de cromatografía de gases para la clasificación del aceite de oliva en las tres categorías, virgen extra, virgen y lampante. Terminé mi trabajo en octubre de 2020, pero actualmente estoy esperando la evaluación para entrar en un programa de doctorado en la misma Universidad». Desde el reciente anuncio de la Conferencia Final de OLEUM, las Redes también están recibiendo mucha atención con inscripciones diarias. Nosotros, miembros del proyecto OLEUM, tenemos muchas ideas sobre el futuro de la Red OLEUM más allá del fin oficial del proyecto. Pero, ante todo, nos gustaría conocer su opinión. Únase a la Red (para LinkedIn aquí). Si está interesado en escuchar lo que se debatió sobre los próximos movimientos de la Red en la conferencia final de OLEUM, busque la grabación de la conferencia aquí.

Dos materiales de referencia sensoriales

Prof. Alessandra Bendini, Dr. Diego Luis García González, Prof. Tullia Gallina Toschi
 

En el caso del aceite de oliva virgen, la evaluación sensorial es un método estándar y, según las normas del Consejo Oleícola Internacional (COI) y otros reglamentos nacionales e internacionales (Reglamentos de la UE, Codex Alimentarius), su aplicación es obligatoria para establecer los posibles grados de calidad (por ejemplo, para la UE: virgen extra, virgen, lampante) y para comercializar el producto. 
 

Los laboratorios que aplican los métodos analíticos deben demostrar su competencia en la aplicación de los métodos de ensayo, siguiendo los procedimientos descritos por la UE y el COI, con ensayos que aseguren la validez de los resultados: este proceso de validación debería realizarse con Materiales de Referencia (MR). De hecho, el uso de MR se menciona como necesario para el análisis sensorial en la normativa vigente (COI/T.28/Doc.no.1/Rev.4; COI/T.20/Doc. no.14/Rev.5). 
 

El uso de materiales de referencia (MR) para los que se pueden asociar valores numéricos definitivos a diferentes atributos sensoriales es absolutamente necesario para calibrar el proceso de medición, ayudar a los evaluadores en la memorización de los estímulos sensoriales y comparar su juicio con los "valores asignados" y así mejorar sus capacidades individuales. Por estas razones, los MR deberían aplicarse para la supervisión continua de los paneles a lo largo del tiempo, así como para los estudios de control intra-panel e inter-panel. Además, los MR podrían ser muy útiles también para la selección y formación de nuevos evaluadores reclutados durante los numerosos cursos organizados a nivel nacional e internacional por diferentes organizaciones y dirigidos a la formación específica de panelistas sensoriales de aceites de oliva vírgenes. 
 

Para el análisis sensorial de los aceites de oliva vírgenes, en la actualidad sólo se dispone de MR procedentes de matrices naturales (aceites de oliva auténticos que se utilizan como muestras de referencia de defectos sensoriales proporcionadas por el COI, muestras procedentes de pruebas de aptitud o certificadas por al menos tres paneles sensoriales acreditados) para la formación de paneles sensoriales; son eficaces para asemejarse a las muestras reales, aunque tienen algunas limitaciones en su uso a lo largo del tiempo (por ejemplo, disponibilidad limitada, dificultad de obtención, baja homogeneidad año tras año).
 

Los MR que emulan los aromas de defectos avinagrados y rancios han sido formulados con diluciones específicas por el CSIC, utilizando una colección de compuestos volátiles sintéticos diluidos en un aceite de oliva refinado sin sabor a concentraciones específicas (Aparicio-Ruiz et al., 2020, Foods, 9(12), 1870), y luego la UNIBO ha coordinado su evaluación sensorial dentro del consorcio OLEUM (han participado seis paneles), así como en el contexto de la validación interlaboratorio que acaba de concluir (fases de pre-trial y trial proper).
 

Los principales resultados de la validación interlaboratorios fueron:
 

La evaluación de la representatividad de los materiales de referencia (RM1 y RM2), en términos de una valoración por parte de los panelistas de su "utilidad por asemejarse a los defectos sensoriales naturales de avinagrado y rancio": los datos recibidos demostraron que los MR fueron valorados como adecuados por una alta proporción de usuarios finales.
 

El cálculo de las intensidades percibidas de los defectos avinado-avinagrado y rancio (RM1 y RM2) porque la definición de la intensidad de cada MR sensorial es una información fundamental para permitir su posible uso en el futuro en la formación de evaluadores: se alcanzó la alineación entre los paneles respecto a la intensidad del defecto en cada MR.

Software para estimar la «fecha de consumo preferente» de los AOVEs

Maurizio Servili y Tullia Gallina Toschi

El nivel y el ritmo de deterioro de la calidad de los AOVEs están relacionados con su composición química y las condiciones de almacenamiento (envasado, temperatura y exposición a la luz), y se ha documentado exhaustivamente que son extremadamente variables según esos factores. La fecha de consumo preferente (FCP) de un AOVE que debe indicarse en la etiqueta (es decir, el periodo mínimo de almacenamiento en el que los aceites de oliva vírgenes conservan sus parámetros químicos y sensoriales dentro de los correspondientes a la categoría declarada) depende del momento decidido por el productor para el envasado y la información objetiva sobre el tiempo transcurrido desde la producción (si el 100 % del contenido del envase procede de esa cosecha) corresponde al año (o mes) de cosecha. 
 

¿Cómo pueden los productores proporcionar una FCP fiable para su AOVE?, con fundamento científico, ¿ya que en la actualidad no disponen de métodos objetivos para orientarse? La disponibilidad de una herramienta para determinar la FCP y su uso preventivo representaría la mejor táctica de defensa contra la pérdida de confianza de los consumidores y el riesgo de acusaciones de fraude. 

Para llenar este hueco, en el marco del proyecto OLEUM se ha desarrollado y validado un software capaz de predecir la FCP de un determinado AOVE en unas condiciones de almacenamiento determinadas. 

Para alcanzar el objetivo final, se han construido modelos de predicción a partir de una gran base de datos analíticos elaborada siguiendo la evolución de los parámetros analíticos seleccionados en un experimento de vida útil en tiempo real de 20 muestras de AOVE, elegidas según el criterio de calidad óptima utilizando el algoritmo del Compuesto Más Descriptivo (CMD), con el fin de cubrir el todo el rango experimental de aceites caracterizados por combinaciones de baja, media y alta concentración de ácidos grasos seleccionados, fenoles y tocoferoles.

Esas 20 muestras de AOVE se caracterizaron analíticamente por completo según parámetros de calidad legal, perfil de ácidos grasos, antioxidantes (fenoles y tocoferoles), composición de compuestos volátiles, diacilgliceroles (DAGs) e índice de estabilidad del aceite (OSI, por su sigla en inglés), y se embotellaron en vidrio con protección frente a rayos UVA, colocándose en estanterías durante 12 meses a la exposición a la luz (durante 12 h/día; 25 °C) y durante 24 meses en la oscuridad (25-30-35 °C). Las tomas de muestras y análisis se han realizado mensualmente para la exposición a la luz y cada dos meses para la oscuridad.

Los parámetros analizados durante la vida útil en tiempo real para la construcción del modelo fueron: acidez, índice de peróxido, K232, K270, ∆K, fenoles, α-tocoferol, compuestos volátiles y composición de ácidos grasos.
 

El conjunto de datos obtenidos de los resultados analíticos se utilizó para construir dos modelos predictivos diferentes, uno para la exposición a la luz y otro para las condiciones oscuras de almacenamiento.
 

Estos modelos predictivos se construyeron mediante un enfoque estadístico multivariado y los coeficientes para calcular el tiempo que faltaba para alcanzar los valores umbral de los parámetros legales de calidad seleccionados, con el fin de determinar las FCPs, se extrapolaron a través de los dos modelos.
 

La capacidad de predicción se evaluó mediante una validación interna y una externa, mostrando una precisión satisfactoria en la previsión de la fecha en la que se superarán los parámetros de calidad y/o legales más importantes (en términos de K270, la concentración de fenoles, umbral de compuestos volátiles de impacto para el defecto de rancidez).
 

El software se ha desarrollado con una interfaz intuitiva, de modo que las entradas para predecir la FCP de un AOVE son: nombre de la muestra, condiciones de almacenamiento (luz/oscuridad y temperatura) y una selección de parámetros analíticos. El resultado está representado por el tiempo de superación del valor umbral (en meses).  La precisión de la predicción de la FCP es satisfactoria para proporcionar una herramienta para satisfacer las necesidades de los productores y para reforzar la confianza de los consumidores. 

Las disoluciones madres estándares para su aplicación en el análisis de los compuestos volátiles

Los atributos sensoriales positivos y negativos en los aceites de oliva vírgenes (AOV) dependen estrictamente de la composición de la fracción volátil. Hasta la fecha, la evaluación organoléptica en los AOV, en cuanto a la presencia e intensidad de estos atributos sensoriales, se realiza según un método conocido como Panel test. Dada la posibilidad de discrepancia en la clasificación de los AOVs por parte de diferentes paneles, una confirmación proveniente del análisis cualitativo y cuantitativo de los compuestos orgánicos volátiles (COVs) específicos responsables de los defectos o de los atributos positivos ha adquirido un enorme interés. En este contexto, el proyecto OLEUM ha propuesto métodos para el análisis de los compuestos volátiles en los AOVs basados en diferentes técnicas analíticas: desde las más consolidadas, como SPME-GC-FID y SPME-GC-MS, hasta las más innovadoras, como HS-GC-IMS, esta última siendo más adecuada para un cribado (“screening”), que puede ser utilizada para la clasificación de los AOVs en sus respectivas categorías de calidad (virgen extra, virgen y lampante). Una información cualitativa y cuantitativa instrumental puede ser relevante para apoyar la prueba del Panel y eventualmente, una vez validadas las respuestas/marcadores, establecer los límites de concentración de los compuestos relevantes para las diferentes categorías de calidad. Sobre la base de las investigaciones analíticas realizadas en el marco del proyecto OLEUM, se seleccionaron 18 compuestos volátiles con el objetivo de disponer de un conjunto con un número mínimo de compuestos con capacidad altamente diagnóstica y fácilmente disponibles en el mercado. Se agruparon en dos matrices estándares (SMA y SMB), disueltas en aceite de oliva refinado, para reducir drásticamente el número de análisis para la preparación de las curvas de calibrado. La selección de los 18 compuestos volátiles en SMA o SMB se basó: i) en su presencia habitual en los AOVs (en elevada o baja concentración) y ii) en la necesidad de limitar los posibles solapamientos entre los compuestos, que de otro modo dificultarían la integración de los picos, facilitando así la comparación interlaboratorios de los resultados.
 

Las mismas mezclas pueden utilizarse también como material de calibración para desarrollar métodos de detección rápida; como se ha publicado recientemente en Foods, al menos 15 de los 18 compuestos volátiles pueden eluirse y detectarse mediante HS-GC-IMS. La composición de estas matrices se ha presentado en algunos eventos públicos y se describe en detalle en otro artículo científico publicado en Food Control.

Instrumento basado en la técnica de reflectometría en el dominio de tiempo útil para la detección de mezclas de AOVEs con aceites de oliva desodorizados suavemente

La reflectometría en el dominio de tiempo es una técnica muy conocida que se utiliza en varios campos: comprobación de discontinuidades en líneas eléctricas, determinación de la humedad del suelo, caracterización dieléctrica de materiales alimentarios y no alimentarios. Esta técnica se basa en la respuesta de la materia a un paso electromagnético según el tiempo que tarda en atravesar y reflejarse, y cambia su forma en función de la composición químico-física y estructural del material. Cuanto más pequeña sea la muestra, más rápido debe ser el paso electromagnético. 

Los aceites de oliva virgen extra (AOVEs) y los aceites de oliva desodorizados (AODs) son químicamente diferentes: por ejemplo, tienen un contenido diferente de ésteres etílicos de los ácidos grasos (EEAGs). Las técnicas analíticas convencionales para determinar los EEAGs son complejas, requieren mucho tiempo y necesitan reactivos. En el contexto del proyecto, se consideró la posibilidad de determinar el contenido de EEAGs y discriminar entre mezclas de AOVEs y AODs mediante TDR. La instrumentación utilizada era capaz de generar y adquirir la en el dominio del tiempo solo con una subida del orden de unas decenas de picosegundos y, en consecuencia, se ha podido utilizar una sonda y así solo necesitar unos pocos ml de muestra. 

La forma de las señales reflejadas se analizó mediante un análisis multivariante: utilizándo la Regresión de Mínimos Cuadrados Parciales (PLS, por su sigla en inglés) para construir modelos predictivos del contenido de EEAGs y se aplicó el Análisis Discriminante PLS (PLS-DA) para discriminar entre las mezclas. Los EEAGs se predijeron con una regresión caracterizada por un coeficiente de determinación (R2) de alrededor de 0,81 y con un error cuadrático medio (ECM) del orden de una decena de mg/kg. Las mezclas de AOVEs y AODs con un contenido de EEAGs superior o inferior a un límite seleccionado (35 mg/kg) se clasificaron correctamente.Aunque los resultados obtenidos deben ser corroborados con pruebas de confirmación teniendo en cuenta variables como la temperatura, que pueden influir en la precisión, la técnica parece prometedora, al menos para merezca ser probada. 

En la actualidad, las mediciones de TDR, como las que aquí se realizan, requieren una instrumentación genérica, multifuncional y de alto coste (por ejemplo, un osciloscopio), y personal experto en mediciones electrónicas y análisis estadístico de datos; pensando en una difusión en el mercado de una instrumentación para las determinaciones de EEAGs, seguramente será necesario combinar dispositivos y automatizar los procedimientos de calibración y las funciones de análisis en una herramienta dedicada y no demasiado cara. La implantación y comercialización de un dispositivo de este tipo, de un coste cercano a los tres mil euros, podría resultar atractiva para las empresas que fabrican instrumentación analítica para pruebas de evaluación.

La base de datos de OLEUM

Tatyana Dimitrova, Alain Maquet, Viet Mai Hoang, Arantza Respaldiza, Alexander Kerner

Una búsqueda e inventario de las bases de datos existentes sobre aceitunas y aceites de oliva puso de manifiesto la escasez de este tipo de sistemas (por ejemplo, el sistema ISAMM para los controles de conformidad de los aceites de oliva gestionado por la CE) para controlar la autenticidad de este producto alimentario. Las consultas a los “stakeholders”, incluidos los organismos nacionales de control, confirmaron la escasez de estas bases de datos, lo que refuerza su interés por un sistema común, compartido por los Estados miembros y basado en métodos analíticos normalizados.
 

Durante el proyecto, se desarrolló “Oleum Databank” como una innovadora plataforma de acceso a la web para almacenar los documentos y datos analíticos validados generados por el consorcio OLEUM. Este sistema se ha desarrollado utilizando únicamente tecnologías modernas y de código abierto y ofrece una gran flexibilidad. La base de datos de Oleum podría considerarse formada por tres módulos básicos: Repositorio, Base de Datos y Herramienta de Búsqueda con una sofisticada gestión de roles y accesos.
 

El repositorio está dedicado a almacenar documentos (en cualquier formato como pdf, doc, xls, etc.) con metadatos que describen cada documento individual incluyendo el título del documento, autor(es), fecha de creación, fecha de carga en el repositorio, breve descripción, propósito, categoría, estado y política de acceso. Los metadatos se utilizan en la opción de búsqueda del repositorio. El usuario que carga el archivo en el repositorio decide qué política de acceso debe aplicarse al documento. Actualmente, los documentos pueden almacenarse como hoja de cálculo, plantilla de archivo de Informe, Procedimiento Operativo Estándar (POE), especificaciones de un material de referencia e informe de validación. Este módulo soporta el control de versiones, por lo que cada documento actualizado puede ser rastreado cuando se hace mención en un experimento.
 

La base de datos está construida para gestionar y rastrear los experimentos. En resumen, un usuario desarrolla un experimento seleccionando los participantes, las técnicas que utilizarán en las muestras, las magnitudes vinculadas a las técnicas seleccionadas y crea una plantilla de informe incluyendo los metadatos de estas entidades y las magnitudes notificadas por los participantes. El sistema es bastante flexible y permite a los usuarios modificar, añadir y establecer descriptores obligatorios y opcionales para cualquier entidad existente o nueva. La contrapartida de esta flexibilidad es un control estricto de las modificaciones de los metadatos para evitar una multitud de variantes en los mismos. Esta estructura tiene como objetivo permitir a cualquier usuario no involucrado en un experimento comprender, gracias a todos los metadatos, todos los detalles sobre los objetivos, las condiciones y los resultados del experimento o los experimentos de interés. Por ejemplo, los metadatos de una muestra describen una muestra de referencia (la información se rastrea desde el campo hasta el aceite embotellado) o una muestra de referencia (se puede rastrear una gran cantidad de información) o una muestra experimental (información disponible sobre un producto) que incluye los datos obligatorios/voluntarios mencionados en la normativa comunitaria correspondiente. Cabe decir que, además del aceite de oliva, se pueden registrar otros aceites comestibles. Cualquier método analítico puede potencialmente manejarse con los metadatos adecuados, incluidos los métodos propuestos por el proyecto OLEUM, pero también los utilizados por los Estados miembros para comprobar la conformidad de los aceites de oliva.
 

El módulo de Búsqueda permite al usuario buscar cualquier palabra clave en toda la Base de Datos OLEUM, en cada una de las diferentes categorías de datos de la entidad: documentos, muestras, conjuntos de muestras, experimentos, resultados y técnicas. Es muy potente y permite al usuario explorar los datos disponibles en el la Base de Datos. Los resultados de la búsqueda se presentan en una tabla flexible que se utiliza para la visualización permitiendo seleccionar los campos a visualizar, aplicar diferentes filtros, dimensionar las columnas, ordenar cada campo, etc. El contenido de cada una de estas tablas puede ser exportado como un simple archivo csv y analizado localmente en el PC por el usuario.
 

A corto plazo, la Base de Datos se abrirá al público, lo que requerirá un registro para alimentar y explotar la base de datos, con el fin de demostrar la capacidad de diagnóstico de los métodos analíticos/de medida seleccionados para detectar aceites de oliva adulterados. A medio plazo, en función del interés de los organismos nacionales de control, podría restringirse su acceso por razones de confidencialidad.

Método rápido de espectroscopia de fluorescencia

Un método para detectar la cantidad de compuestos fenólicos lipofílicos bioactivos (tocoferoles o vitamina E)

Los aceites de oliva frescos contienen una cantidad variable de tocoferoles, unas moléculas fenólicas lipofílicas que se caracterizan por su actividad antioxidante y vitamínica (específicamente el alfa-tocoferol es la forma capaz de desempeñar el papel de vitamina E). 
 

Sin embargo, como estos compuestos son sensibles a la oxidación, su nivel disminuye durante el almacenamiento del aceite (dependiendo de las condiciones adoptadas y de la composición natural de la muestra de aceite). 
 

El análisis fluorescente de los aceites de oliva aprovecha la presencia de componentes fluorescentes naturales (por ejemplo, clorofilas y derivados), incluidos los tocoferoles. 
 

La obtención de los espectros de fluorescencia de las muestras de aceite de oliva se realizó utilizando un instrumento con un lector de placas negras de 96 pocillos. 
 

Las mediciones (excitación a 302 nm y emisión a 328 nm) se realizaron transfiriendo directamente una pequeña cantidad de muestra de aceite (250 µl) sin ningún tratamiento adicional (como dilución y extracción, véase la Figura 1).
 

Los resultados de los análisis de fluorescencia de las muestras de aceite de oliva utilizando esta herramienta han resultado tener una alta correlación con la cuantificación por HPLC del contenido de alfa-tocoferol (véase la Figura 2) y este método fue validado con éxito en la empresa (por ejemplo, en términos de parámetros como precisión, exactitud, límite de detección, límite de cuantificación, robustez).
 

Este enfoque puede permitir una evaluación rápida y de alto rendimiento de la cantidad total de tocoferoles en muestras de aceites de oliva sin casi ninguna preparación de la muestra.

Figura 1: Diagrama de flujo del ensayo: se echan 250 µl de aceite de oliva virgen se transfieren en una placa de 96 pocillos y se someten a un análisis espectroscópico de fluorescencia.

Figura 2: Correlación entre las concentraciones de alfa-tocoferol determinadas por el ensayo espectroscópico de fluorescencia y por el método de referencia HPLC-FLD.

Sistema portátil con pilas para la determinación de la acidez libre en el aceite de oliva virgen

Diferentes factores afectan la calidad del aceite de oliva, como el proceso de extracción y el estado de maduración del fruto, así como las condiciones de almacenamiento (luz y temperatura). Para determinar la calidad del aceite de oliva se evalúan una serie de parámetros (por ejemplo, la acidez libre, el índice de peróxidos), así como los atributos sensoriales. La acidez libre es el primer y más importante parámetro de la calidad del aceite y el método oficial para su determinación es una valoración química que debe realizarse en un laboratorio por personal capacitado.
 

El objetivo de este proyecto es el desarrollo de una técnica novedosa para la determinación de la acidez libre del aceite de oliva que pueda ser fácilmente implementada, como un sistema electrónico portátil para que operadores sin formación específica puedan realizar mediciones rápidas y precisas de campo. Esto permite, incluso a los centros de producción más pequeños (almazaras y centros de envasado) que no pueden permitirse un laboratorio interno para el análisis, realizar mediciones de acidez libre in situ sin los costes y retrasos asociados al envío de la muestra a un laboratorio externo.
 

El principio de funcionamiento de la medición se basa en la Espectroscopia de Impedancia Eléctrica (EIE), una técnica en la que se aplica una tensión sinusoidal a la muestra que se está analizando y se miden sus características eléctricas en un rango de frecuencias. En este caso, la muestra sometida a prueba es la emulsión entre una solución hidroalcohólica (etanol 60%, agua destilada 40%) y la muestra de aceite de oliva. Se han realizado investigaciones preliminares utilizando un analizador comercial de impedancia (Agilent E4980A) en el rango de frecuencias de 20 Hz a 2 MHz. Los resultados han demostrado que existe una correlación entre la acidez libre de aceite y la conductancia eléctrica de la emulsión medida a bajas frecuencias (< 10 kHz).
 

Se ha diseñado y construido un sistema portátil integrado para la medición in situ de la acidez libre del aceite de oliva. El instrumento tiene un tamaño de 11 x 15 x 5 cm y puede ser alimentado por el puerto USB o por pilas (3 pilas alcalinas AAA de 1,5 V). La placa electrónica, basada en el microcontrolador STM32L152RCT6A de ST Microelectronics, integra una pantalla LCD para mostrar los resultados de las mediciones, cuatro botones para la interacción con el usuario y el sistema electrónico para las mediciones eléctricas (mediciones de conductancia eléctrica a 200 Hz). La emulsión (15 mL de solución hidroalcohólica y 1 mL de aceite de oliva) se aloja en un vial Falcon de 50 mL modificado para incorporar un par de electrodos de acero inoxidable (de 6 mm de diámetro, separados por 12 mm) para las mediciones eléctricas. El instrumento ha sido calibrado y la curva de calibración almacenada en la memoria del microcontrolador. El instrumento puede realizar mediciones de acidez libre en unos 30 segundos.
 

Tras la calibración, el sistema ha sido validado internamente realizando mediciones en un conjunto de 30 muestras de aceite de oliva de diferentes orígenes con valores de acidez libre entre 0,18 y 4,5 (Grossi, M.; Palagano, R.; Bendini, A.; Riccò, B.; Servili, M.; García-González, D. L.; Toschi, T. G.; Design and in-house validation of a portable system for the determination of free acidity in virgin olive oil. Food Control, 2019, 104, 208-216). La precisión del sistema se ha evaluado comparando los datos obtenidos del instrumento con los resultados del método oficial. Se encontró una buena correlación con el método oficial (Radj = 0,97) y se obtuvieron resultados satisfactorios en términos de límite de detección, límite de cuantificación, precisión y exactitud.

Estudios entre laboratorios

Paul Brereton (Queen’s University Belfast)
 

Durante los últimos meses de la actividad de OLEUM, todos los socios del proyecto han estado muy ocupados analizando gran cantidad de datos. Esto se debe a que estamos completando uno de los mayores estudios entre laboratorios del mundo. En realidad, se trata de un conjunto de estudios que incluyen 8 métodos analíticos diferentes con aproximadamente 15 laboratorios para cada método, que analizan 10 materiales de prueba, es decir, más de 1000 datos. Además, algunos métodos tienen dos analitos y dos de ellos tienen 18 (¡!), ¡lo que hace que haya que analizar más de 5000 resultados!
 

Los métodos que se estudian son:

     1. Análisis de los fenoles polares utilizados para evaluar la declaración de propiedades saludables del aceite de oliva

     2. Análisis de esteroles libres y esterificados para mezclas ilegales de aceite de oliva

     3. Mejora de la metodología para los ésteres etílicos de ácidos grasos teniendo en el punto de mira la producción ilegal o de aceite de oliva virgen de menor calidad

     4. Un grupo de métodos para el análisis sensorial y de volátiles para la calidad y autenticidad del aceite de oliva virgen 

          a. Análisis de los compuestos volátiles seleccionados en el aceite de oliva virgen mediante cromatografía de gases

               i. GC-MS

               ii. GC-FID 

          b. Análisis de la huella dactilar volátil del aceite de oliva virgen por SPME-GC-MS y quimiometría, como método de evaluación de apoyo para el Panel test

          c. Análisis sensorial de los aceites de oliva vírgenes utilizando dos materiales de referencia 
 

Los métodos mencionados van desde ligeras mejoras de los métodos existentes, como, por ejemplo, los métodos 2 y 3; hasta nuevos procedimientos avanzados de análisis múltiples/procesos de perfilado que pretenden complementar el Panel Test oficial (análisis sensorial).
 

Tras un estudio preliminar realizado en el primer semestre de 2020, la mayor parte del estudio principal, o "ensayo propiamente dicho", tuvo lugar en otoño de 2020. Para cada uno de los métodos mencionados, se envió a cada laboratorio participante un procedimiento operativo estándar y un conjunto de muestras (normalmente 10 materiales de prueba y una muestra de práctica con un valor conocido) para analizar una sola vez. Sin que los participantes lo supieran, los materiales de prueba constaban en realidad de 5 conjuntos de materiales de prueba duplicados que nos permiten calcular la precisión dentro del laboratorio y entre laboratorios.  Una vez realizadas las estadísticas según las normas reconocidas internacionalmente, los métodos estudiados pueden evaluarse para determinar su idoneidad como métodos oficiales.
 

Los resultados formalizados estarán disponibles en breve, una vez que hayamos compartido los resultados con los participantes y hayamos cerrado formalmente el estudio. A continuación, algunos de los procedimientos se propondrán como métodos oficiales.
 

Queremos aprovechar esta oportunidad para agradecer a todos los laboratorios que han participado en este enorme ejercicio, sobre todo que lo han hecho en circunstancias extremadamente difíciles (Covid-19).

La revolución de control de calidad y autenticidad de OLEUM

De la sostenibilidad a los macrodatos para el cumplimiento de la normativa

Por Tullia Gallina Toschi
 

El proyecto OLEUM ha finalizado con una conferencia pública celebrada los días 17 y 18 de febrero y disponible en vídeos descargables desde el sitio web del proyecto. Los objetivos del proyecto eran pragmáticos. OLEUM no estaba dispuesto a investigar exhaustivamente los posibles marcadores de calidad de los aceites de oliva, independientemente del coste y la disponibilidad real de los instrumentos en los laboratorios de control de calidad. OLEUM quería identificar nuevos métodos aplicables en las condiciones existentes o reducir el tiempo de análisis, los disolventes y los consumibles de los métodos ya reconocidos legalmente. Las palabras clave eran «renovar» o «revisar». A día de hoy la importancia de la unión entre proyecto y elementos fundamentales de la sostenibilidad es evidente. La propuesta de investigación de OLEUM, enviada a la Comisión el 26 de junio de 2014, ha anticipado, por ejemplo, algunas metas del objetivo 12 de la agenda 2030, adoptada por la ONU en septiembre de 2015, como la necesidad de reducir la liberación y el no reciclaje o el desperdicio de productos químicos (objetivo 12.4) y desde este punto de vista el enfoque de OLEUM puede extenderse a muchos otros alimentos.
 

El otro aspecto fundamental del proyecto era la combinación de prevención y control. Todos los stakeholders de la calidad de un alimento tan preciado como el aceite de oliva virgen extra (AOVE) se sentaron en la misma mesa: los pequeños o medianos productores, que quieren que el aceite sea justamente remunerado; los grandes productores o envasadores, que necesitan un margen adicional y que necesariamente deben ofrecer al mercado calidades y precios diferentes, pero que no quieren seguir encontrándose en condiciones de incumplimiento y por debajo de la calidad legal y los laboratorios públicos de control que deben y quieren realizar controles con métodos altamente diagnósticos, sólidos, rápidos, eficaces y normalizados en todos los territorios. Por último, pero no por ello menos importante, el consumidor, que debe estar informado sobre un producto muy utilizado, pero poco conocido en esencia, y que quiere garantías de calidad. Por ello, OLEUM se ha movido en dos direcciones: desarrollando métodos de evaluación rápida útiles para la prevención y el control de calidad en las empresas, y desarrollando en paralelo, con una estrecha relación, métodos altamente sensibles y específicos que se propondrán a las mesas de normalización para su adopción en los controles públicos de calidad.
 

Uno de los problemas era la calidad sensorial. Representa uno de los tres pilares fundamentales de la calidad del AOVE, junto con los estrictos elementos de «frescura» (que puede definirse como la calidad del aceite en el momento cero) y la integridad de las aceitunas de origen. La especificidad tecnológica, al ser el AOVE un producto únicamente prensado, centrifugado y filtrado (no refinado), es una cualidad importante, compartida con el aceite virgen (AOV) que no cuenta con parámetros de calidad tan rigurosos como el anterior. Sin una calidad sensorial impecable, el AOVE no existiría, aunque este elemento sigue siendo uno de los más difíciles de evaluar. Es destacable que la mayoría de las no conformidades se refieran a los aspectos sensoriales. Por ello, OLEUM, aprovechando toda la bibliografía sobre este tema, ha desarrollado y validado dos métodos cromatográficos de alta resolución (SPME-GC/MS y SPME-GC/FID) destinados a los laboratorios de control público que se pondrán sobre la mesa del Consejo Oleícola Internacional para que sean adoptados una vez que se establezcan los límites y rangos para los marcadores más relevantes. Estos métodos instrumentales pueden combinarse con el Panel Test (evaluación sensorial) en caso de clasificaciones dudosas.
 

Paralelamente, se utilizaron los mismos parámetros, es decir, el número mínimo de compuestos volátiles considerados altamente diagnósticos (15-18 compuestos), para proponer métodos de evaluación rápida capaces, por ejemplo, de preclasificar el producto AOVE en función de su calidad sensorial. Estos métodos serán especialmente útiles para que los embotelladores decidan rápidamente si comprar o no un lote de aceite.
 

El reto de OLEUM, que también ha creado una red internacional, que reúne a los stakeholders, amplía los conocimientos sobre el aceite de oliva y el AOVE, y promueve a la vez la competitividad del producto y los métodos de control como parámetro positivo. Se trata de parámetros de autenticidad y calidad normalizados, de una sólida cultura científica y compartida, que aíslan sólo a los defraudadores, no alimentan las cadenas de promoción negativa y los detractores del producto, sino que se dirigen a dar en la práctica más elementos de certidumbre.
 

Por último, no me detengo en las numerosas direcciones en las que se ha movido el proyecto para buscar nuevos marcadores y métodos. Sólo puedo remitirme a la página del sitio web en la que se recogen todos los artículos publicados hasta la fecha y disponibles en acceso abierto, y destaco que OLEUM también se ha concentrado en la dirección vanguardista de proponer, por primera vez, la validación de un método no dirigido.
 

También es imprescindible mencionar el arduo trabajo de investigación que ha supuesto la puesta en marcha de materiales de referencia (MR): se han elaborado y validado cuatro. Dos materiales sensoriales, rancio y avinagrado, y dos estándares de compuestos volátiles que se utilizarán como material de calibración instrumental. Todos ellos están listos para el mercado. También en este caso, el control de calidad del aceite de oliva abre el camino a un mercado alimentario más amplio.
 

Para concluir e intentar dar una orientación estratégica al futuro de los controles de calidad y a la autenticidad del aceite de oliva, una vía prometedora que la UE podría tomar incluye: 
 

1. una estrategia conjunta, para combinar datos sensoriales e instrumentales (¡ahora es asequible una cuantificación fácil de volátiles específicos!), útil en casos de desacuerdo entre dos paneles;
2. una mejora de la competencia y la alineación de los paneles mediante la calibración mutua, posible en un futuro próximo, si los materiales de referencia (MR) reproducibles estarán disponibles en el mercado;
3. composiciones conformes reales y virtuales implementadas progresivamente y almacenadas (virtualmente) en un repositorio de datos validados (por ejemplo, el banco de datos OLEUM) que se utilizará como referencia de autenticidad;
4. La información sobre la calidad y la autenticidad de los aceites de oliva debe relacionarse con los volúmenes producidos y su geolocalización. La intersección entre los controles de calidad oficiales y la trazabilidad, propia de un escenario de blockchain, podría ser la próxima medida contra el fraude

Todo pasa de un único marcador de calidad y autenticidad a una visión en conjunto de un aceite que podría definirse como «biométrica». Pero no podemos olvidar proceder con un enfoque incremental, simple y sólido, desgranando gradualmente elementos de complejidad para hacer una nueva síntesis efectiva, evitando cualquier sensacionalismo, que introduce incertidumbre y aproximación. Este es el difícil reto que ha ganado OLEUM.

Conferenza finale del progetto OLEUM

Il 17 e 18 febbraio 2021 si è svolta con successo la conferenza finale del progetto OLEUM. In totale, oltre 400 persone, provenienti da diversi settori, si sono registrate all'evento online per rimanere aggiornate sui risultati del progetto e discutere le possibilità future per garantire la qualità e l'autenticità dell'olio di oliva.

L'evento si è tenuto su due giornate, delle quali la prima dedicata ai risultati e agli impatti di OLEUM sul futuro delle politiche europee e la seconda incentrata sugli strumenti e metodi analitici innovativi per garantire maggiormente la qualità e l'autenticità dell'olio d'oliva.

Il Prof. Giovanni Molari, Direttore del Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agro-Alimentari dell'Università di Bologna, ha aperto i lavori prima che la coordinatrice del progetto, Prof.ssa Tullia Gallina Toschi, illustrasse i risultati più importanti del progetto e affermasse che le opportunità che ne derivano sono di grande interesse ed estremamente preziose per la filiera ed il mercato oleario. I risultati forniti dal progetto potranno essere rilevanti per lo sviluppo di future politiche europee, in materia di olio di oliva.

"Dobbiamo avere un ruolo divulgativo, semplice e di appeal, fondato su contenuti tecnicamente corretti, per spiegare e diffondere cosa sia l’olio di oliva ed in particolare l’olio extra vergine". – Prof.ssa Tullia Gallina Toschi

L’OLEUM Network, in continua crescita, raccoglie e amplia le competenze nell'analisi e autenticazione degli oli di oliva, veicolando i metodi e gli strumenti innovativi sviluppati nel progetto, in modo da contrastare le attività fraudolente e proteggere la qualità del prodotto. I risultati ottenuti con i metodi pubblicati e validati possono essere archiviati nell’ OLEUM Databank, uno dei risultati chiave del progetto, che migliorerà lo scambio di informazioni tra i diversi portatori di interesse. A causa delle tante informazioni errate sull’olio di oliva, una parte importante del progetto è stata dedicata a fornire al pubblico notizie affidabili e scientificamente provate.

I metodi sviluppati nell’ambito del progetto sono stati introdotti e spiegati dai ricercatori che li hanno proposti durante il secondo giorno della conferenza finale di OLEUM. I partecipanti hanno ricevuto una panoramica generale del background tecnico e hanno avuto la possibilità di chiarire i propri dubbi in una sessione dedicata alle “domande e risposte” con gli sviluppatori.

I commenti giunti nella chat e sui social media alla fine della conferenza sono stati ottimi e il team del progetto OLEUM desidera ringraziare tutti le/i partecipanti e le/i relatori/trici per aver reso possibile tutto questo!

Per maggiori informazioni sui principali risultati del progetto, le registrazioni della conferenza finale e altre risorse, è possibile consultare il pacchetto virtuale: Clicca qui

La registrazione della conferenza finale è scaricabile qui!

Il Network OLEUM

Tassos Koidis, Paul Breton ed Enrico Valli
 

Dalla nostra ultima comunicazione, l’OLEUM Network è in costante crescita, sia in termini di contenuti che di membri. Attualmente sono presenti 120 membri all’interno della piattaforma OLEUM Basecamp (18%, in crescita) e 164 membri (21%) all’interno del gruppo Linkedin “Question of the Month”. Sono state pubblicate 3 aggiuntive domande e risposte (Q&A) (Q1: Vero o Falso? Il riscaldamento dell'olio d'oliva porta alla produzione di acidi grassi trans. D2: Cos'è l'olio remolido? D3: L'EVO spremuto a freddo è sempre di qualità superiore al normale VOO?). 
 

Per molti membri di OLEUM, che hanno condotto gli studi di validazione dei metodi conclusisi poco prima di Natale, è stato un periodo estremamente impegnativo. Per questi membri, che lavorano in laboratori pubblici e privati, come Jorge di Sovena, è risultato molto utile poter accedere liberamente, attraverso le Risorse dell’OLEUM Network, ai materiali di formazione riguardanti i due workshop OLEUM, che si sono svolti in Spagna (19 ottobre) e in Italia (19 dicembre). Inoltre, ultimamente, si sono uniti al Network OLEUM anche molti altri studenti, come Gabriela dell'Università di Cordoba (Spagna), che scrive: "Avevo bisogno di informazioni sull'olio d'oliva per preparare il mio progetto finale del Master e, in particolare, sulle tecniche gascromatografiche per la classificazione dell'olio di oliva nelle tre categorie merceologiche extravergine, vergine e lampante. Ho terminato il mio lavoro nell'ottobre 2020, ma al momento sono in attesa della valutazione per accedere a un corso di dottorato nella stessa Università”. Durante e dopo la conferenza finale di OLEUM, i Network hanno ottenuto molta visibilità attraverso le iscrizioni. Noi come partecipanti al progetto OLEUM, abbiamo molte idee sul futuro dell’OLEUM Network, che vanno oltre la fine ufficiale del progetto. Prima di tutto, però, ci piacerebbe conoscere la tua opinione. Unisciti alla rete (per LinkedIn qui) e se sei interessato/a a conoscere i nostri prossimi avanzamenti discussi durante la conferenza finale. A questo link potrai accedere alla registrazione della conferenza qui.

Due materiali di riferimento sensoriali

Prof. Alessandra Bendini, Dr. Diego Luis García González, Prof. Tullia Gallina Toschi

La valutazione sensoriale, nel caso degli oli di oliva, è normata a livello internazionale (Codex Alimentarius, COI, UE) ed esiste un metodo ufficiale da applicare per verificare l’appartenenza del prodotto ad una specifica categoria merceologica (es. a livello UE: extra vergine, vergine e lampante, quest’ultimo non commestibile).
 

I laboratori che applicano questo metodo devono dimostrare la loro competenza partecipando a test inter-laboratorio come descritto da EU e COI e, nello specifico, in accordo con le norme vigenti (COI/T.28/Doc.no.1/Rev.4; COI/T.20/Doc. no.14/Rev.5), per assicurare la validità dei loro risultati dovrebbero utilizzare dei Materiali di Riferimento. 
 

L’uso di Materiali di Riferimento (RMs) caratterizzati da valori di intensità di specifici attributi sensoriali è fondamentale per permettere agli assaggiatori di calibrarsi in modo corretto grazie alla comparazione del proprio giudizio con valori assegnati, aiutandoli a memorizzare tali stimoli e permettendo loro di migliorare le loro capacità individuali. Per questo, i RMs dovrebbero essere utilizzati per un monitoraggio costante degli assaggiatori di un panel, così come per valutazioni tra panel. Inoltre, i RMs potrebbero essere molto utili nelle fasi di selezione ed allenamento dei nuovi assaggiatori reclutati nell’ambito dei numerosi corsi organizzati a livello nazionale ed internazionale da diverse organizzazioni ed indirizzati alla formazione specifica di panelisti per l’olio di oliva. 
 

Al momento, per l’analisi sensoriale degli oli di oliva, sono disponibili RMs ottenuti da matrici naturali (oli di oliva caratterizzati da specifici difetti sensoriali utilizzati come campioni di riferimento dal COI, campioni utilizzati nell’ambito di test inter-laboratorio o valutati da almeno tre panel accreditati); questi, pur risultando efficaci, presentano alcune limitazioni nell’uso continuativo (es. limitata disponibilità, difficoltà per ottenerli, limitata omogeneità da anno ad anno).
 

Due Materiali di Riferimento, in grado di emulare l’aroma relativo ai difetti di avvinato-inacetito e rancido, sono stati formulati a specifiche diluizioni da CSIC, miscelando molecole sintetiche selezionate a determinate concentrazioni e diluendole in olio di oliva raffinato (Aparicio-Ruiz et al., 2020, Foods, 9(12), 1870); UNIBO ha quindi coordinato la loro valutazione sensoriale che è stata svolta, in una prima fase, dai sei panel che hanno operato nell’ambito del consorzio del progetto OLEUM  e poi nell’ambito dell’inter-validazione appena conclusasi (organizzata nelle fasi di pre-trial e trial proper).
 

I principali risultati ottenuti nell’inter-validazione sono stati:
 

La valutazione della rappresentatività dei due Materiali di Riferimento (RM1 e RM2), in termini di loro ‘utilità nell’assomigliare ai difetti sensoriali naturali di avvinato-inacetito e rancido’: i dati ottenuti hanno dimostrato come questi due RMs siano stati valutati come appropriati da un’elevata percentuale di assaggiatori. 
 

L’assegnazione dell’intensità percepita di avvinato-inacetito e rancido (RM1 e RM2), poichè la definizione dell’intensità dell’attributo è un’informazione fondamentale per permettere l’uso futuro di un RM: i panel sono risultati allineati rispetto all’intensità del difetto di ognuno dei due RM.

Sviluppo di un Software per stimare la “data di scadenza” degli oli extra vergini di oliva

M. Servili¹, A. Taticchi¹, S. Esposto¹, S. Urbani¹, R. Selvaggini¹, G. Veneziani¹, B. Sordini¹, D. L. García González², T. Cruciani G.³ Gallina Toschi⁴

1 Department of Agricultural, Food and Environmental Sciences, University of Perugia, Italy.

2 Instituto de la Grasa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Sevilla, Spain.

3 Department of chemistry, biology and biotechnology, University of Perugia, Italy

4 Department of Agricultural and Food Science, University of Bologna, Italy.

Il livello e la velocità del deterioramento della qualità dell’olio extra vergine (OEVO) sono fortemente influenzati dalla sua composizione chimica e dalle condizioni di conservazione quali la forma di packaging, la temperatura ed esposizione alla luce.
 

La data di scadenza (TMC) di un OEVO da indicare sull'etichetta, è il periodo minimo di conservazione entro il quale gli oli di oliva vergini mantengono i valori dei parametri chimici e sensoriali all'interno di quelli corrispondenti alla categoria dichiarata. Questa è indicata dal produttore sotto la propria responsabilità. Come possono i produttori fornire un TMC affidabile per il loro EVOO, su base scientifica, poiché al momento non ci sono metodi oggettivi per orientarsi? La disponibilità di uno strumento per determinare il TMC e il suo utilizzo preventivo rappresenterebbe la migliore strategia di difesa contro la perdita di fiducia dei consumatori ed il rischio di frode. Al fine di dare risposte a questa problematica, nell'ambito del progetto Oleum, è stato sviluppato e validato un software in grado di prevedere il TMC di un OEVO conservato in determinate condizioni che simulano la permanenza allo scaffale nel punto vendita. Per raggiungere questo obbiettivo sono stati costruiti modelli di previsione dello shelf-life, basati su un ampio database analitico realizzato seguendo nel tempo l'evoluzione di alcuni parametri analitici, collegati all’evoluzione delle stato ossidativo dell’OEVO, su 20 campioni di OEVO. Gli oli sono stati selezionati secondo il disegno D-ottimale, utilizzando l’algoritmo Most Descriptive Compound (MDC), per coprire il dominio sperimentale con OEVO caratterizzati da bassa, media e alta concentrazione in acido oleico, fenoli idrofili e tocoferoli. Su questi 20 campioni sono state eseguite analisi chimiche e chimico fisiche riguardanti i parametri legali la composizione acidica, il contenuto in antiossidanti (fenoli idrofili e tocoferoli) la composizione volatile, il contenuto in DAG e l’OSI test. I campioni sono stati imbottigliati in vetro UV grade, posti sugli scaffali per 12 mesi ed esposti alla luce (per 12 ore/giorno; 25 °C) e per 24 mesi al buio (25,30 e 35 °C) e sottoposti ad analisi mensilmente quelli esposti alla luce e ogni due mesi quelli conservati al buio. L'intero set di dati ottenuti dai risultati analitici è stato utilizzato per costruire due diversi modelli predittivi, uno per l'esposizione alla luce e l’altro per la conservazione al buio. Tali modelli predittivi sono stati costruiti con un approccio statistico multivariato e attraverso questo sono stati estrapolati i coefficienti per calcolare il tempo per raggiungere i valori di soglia dei parametri legali e/o qualitati, al fine di determinare i TMC.
 

La capacità predittiva è stata valutata mediante validazione interna ed esterna, mostrando una soddisfacente accuratezza nella previsione della data in cui verranno superati i più importanti parametri qualitativi e/o legali (in termini di K₂₇₀, concentrazione di fenoli idrofili, soglia di percezione dei composti volatili responsabili del difetto di rancido).
 

Il software, denominato VITA OLEI, è stato sviluppato con un'interfaccia user-friendly, in modo che gli input per prevedere il BBD di un OEVO siano: nome del campione, condizione di conservazione (luce/buio e temperatura) e una selezione di parametri analitici. L'output è rappresentato dal tempo (espresso in giorni) oltre il quale si avrà il superamento del valore di soglia. L'accuratezza della previsione del TMC è soddisfacente per fornire uno strumento per i bisogni dei produttori e per rafforzare la fiducia dei consumatori verso questo prodotto.

Soluzioni standard per l’analisi strumentale dei composti volatili

Gli attributi sensoriali positivi e negativi negli oli di oliva vergini (VOO) sono fortemente legati alla composizione della frazione volatile. Oggi il metodo usato per la valutazione sensoriale dei VOO e quindi di misura dell’intensità degli attributi specifici, è il Panel test. Data la possibilità di disaccordo nella classificazione dei VOO da parte di panel diversi, una possibile conferma/disconferma, basata su metodi strumentali, potrebbe assumere grande importanza; essa potrebbe fondarsi sull'analisi qualitativa e quantitativa di specifici composti organici volatili (VOC), responsabili dei difetti o degli attributi positivi dei VOO . In questo contesto, il progetto OLEUM ha proposto metodi per l'analisi dei composti volatili nei VOO fondati su tecniche analitiche diverse: dalle più consolidate SPME-GC-FID e SPME-GC-MS, alla più innovativa HS-GC-IMS, quest'ultima più adatta per un approccio di screening, utilizzabile per una classificazione rapida preventiva o confermativa dei VOO nelle rispettive categorie merceologiche (extra vergine, vergine e lampante). Una metodologia analitica strumentale che dia informazioni quali e quantitative sui compositi volatili dei VOO, può essere quindi estremamente rilevante per supportare il Panel test ed eventualmente, una volta convalidati i segnali ed i traccianti, per stabilire i limiti di concentrazione dei composti, responsabili dei difetti, discriminanti per le diverse categorie merceologiche. Sulla base delle indagini analitiche svolte nell'ambito del progetto OLEUM, sono stati selezionati 18 composti volatili con l'obiettivo di limitare l’analisi al numero minimo di composti altamente diagnostici e facilmente reperibili sul mercato. Questi composti, disciolti in olio d'oliva raffinato, sono stati raggruppati in due Matrici Standard (SMA e SMB) per ridurre drasticamente il numero di analisi necessarie per la preparazione delle curve di calibrazione. La collocazione dei 18 composti volatili in SMA o SMB è stata effettuata: i) sulla base della loro presenza abituale nei VOO (alta o bassa concentrazione) e ii) per limitare le possibili sovrapposizioni tra composti, che altrimenti ne renderebbero difficile l'identificazione e quantificazione. Con questo approccio di calibrazione il confronto inter-laboratorio dei risultati risulta più facile.
 

Le stesse miscele possono essere utilizzate anche come materiale di calibrazione per lo sviluppo di metodi rapidi di screening; in linea con quanto recentemente pubblicato dalla rivista scientifica Foods, almeno 15 dei 18 composti volatili possono essere eluiti e rilevati da uno strumento HS-GC-IMS. La composizione delle matrici standard matrici è stata presentata ad alcuni eventi pubblici ed è descritta in dettaglio in un articolo scientifico pubblicato su Food Control.

Riflettometria nel dominio del tempo per la rilevazione di miscele di olii extravergine e oli d’oliva “soft” deodorizzati

La Riflettometria nel Dominio del Tempo (RDT) è una tecnica ben nota ed utilizzata in diversi campi: individuazione delle discontinuità nelle linee elettriche, determinazione dell'umidità del suolo, caratterizzazione dielettrica di materiali alimentari e non. La RDT si basa sulla risposta della materia ad un impulso “a gradino” elettromagnetico caratterizzato da un tempo di attraversamento e riflessione, il quale cambia di forma in base alla composizione chimico-fisica e strutturale della materia stessa. Più piccolo è il campione, più veloce deve essere la salita dell’impulso elettromagnetico. 

Gli Oli di Oliva Extra Vergini (OOEV) e gli Oli di Oliva Deodorati, cosiddetti “Soft” (OODS) sono chimicamente diversi, hanno ad esempio un differente contenuto di Esteri Etilici degli Acidi Grassi (EEAG). Le tecniche analitiche convenzionali per la determinazione degli EEAG sono complesse, richiedono molto tempo e reagenti. Nel contesto di Oleum, è stata esplorata la possibilità di determinare il contenuto di EEAG e discriminare tra miscele di OOEV e OODS con la tecnica RDT. La strumentazione utilizzata è in grado di generare ed acquisire la forma d'onda di impulsi con tempi di salita dell'ordine di alcune decine di picosecondi e, di conseguenza, è stato possibile utilizzare una sonda per pochi ml di campione. 

La forma dei segnali riflessi è stata analizzata mediante analisi multivariata: la regressione “PLS” (Partial Least Square) è stata utilizzata per costruire modelli predittivi del contenuto in EEAG mentre l'analisi discriminante “PLS-DA” è stata applicata per discriminare tra le miscele di olii. Il contenuto di EEAG è risultato stimabile con una regressione caratterizzata da un coefficiente di determinazione (R²) di circa 0,81 e con un errore quadratico medio dell'ordine di una decina di mg/kg. Le miscele di OOEV e OODS con contenuto di EEAG superiore o inferiore a un limite selezionato (35 mg/kg) sono state tutte correttamente classificate. Sebbene i risultati ottenuti debbano essere corroborati da ulteriori test che considerino variabili, come la temperatura, che possono influire sull'accuratezza, la tecnica sembra promettente, almeno per uno screening. 

Attualmente, le misurazioni RDT, come quelle qui condotte, richiedono strumentazione generica, multifunzione, ad alto costo (ad es. un oscilloscopio) e personale esperto in misure elettroniche ed analisi di dati statistici; pensando ad una diffusione sul mercato di una strumentazione per la determinazione degli EEAG, sarà certamente necessario unire dispositivi e automatizzare procedure di calibrazione e funzioni di analisi in uno strumento dedicato e non troppo costoso. L'implementazione e la commercializzazione di un siffatto dispositivo, del costo di circa tremila euro, per test di screening, potrebbe essere oggetto di interesse per le aziende che producono strumentazione analitica.

Il Databank OLEUM

Tatyana Dimitrova, Alain Maquet, Viet Mai Hoang, Arantza Respaldiza, Alexander Kerner
 

Una revisione delle banche dati esistenti riguardanti le olive e gli oli di oliva ha evidenziato la scarsità di tali sistemi (ad esempio il sistema ISAMM per i controlli di conformità degli oli vergini di oliva gestito dalla CE) per controllare l'autenticità di questo prodotto. Le consultazioni avvenute tra i vari portatori di interesse del settore, compresi gli organismi di controllo nazionali, hanno confermato la scarsità di tali banche dati, rafforzando l’interesse per la creazione di un sistema comune, condiviso tra gli Stati membri e fondato su metodi analitici armonizzati.
 

Durante il progetto, l’OLEUM Databank è stato creato come una piattaforma ad accesso dal web innovativa, per archiviare documenti e dati analitici convalidati generati dal consorzio OLEUM. Questo sistema è stato sviluppato utilizzando solo tecnologie moderne e open source, offrendo in questo modo maggiore flessibilità. L’OLEUM Databank è costituito da tre moduli di base: Repository, Database e il Search tool, che possiede un ruolo chiave, permettendo un controllo degli accessi.
 

Il Repository è dedicato all'archiviazione dei documenti (in qualsiasi formato, come pdf, doc, xls, ecc.) con metadati che descrivono ogni singolo documento con: titolo del documento, autore/i, data di creazione, data di caricamento nel Repository, breve descrizione, scopo, categoria, stato, politica di accesso. I metadati vengono utilizzati nell'opzione “ricerca” del Repository. L'utente che carica il file all’interno del Repository può decidere quale politica di accesso deve essere applicata al documento. Attualmente, i documenti possono essere caricati come file di calcolo, modello di file di report, procedura operativa standard (SOP), specifica di un materiale di riferimento, report di convalida. Questo modulo permette di rintracciare ogni aggiornamento del documento riferito a uno specifico studio.
 

Il Database è strutturato per gestire e tracciare gli esperimenti. In sintesi, un utente crea uno studio selezionando i partecipanti, quali tecniche useranno su quali campioni, le misurazioni relative alle tecniche selezionate e infine crea un modello di report, includendo i metadati relative allo studio e le misurazioni riportate dai partecipanti. Il sistema risulta abbastanza flessibile, consentendo agli utenti di modificare, aggiungere, impostare descrittori obbligatori e opzionali per qualsiasi entità già esistente o nuova. La chiave di questa flessibilità è un controllo rigoroso sulle modifiche dei metadati per evitare una moltitudine di varianti. Questa struttura mira a consentire a qualsiasi utente non coinvolto in uno studio di comprendere, grazie a tutti i metadati, i vari dettagli sugli obiettivi, le condizioni, i risultati e gli esperimenti di interesse. Ad esempio, i metadati di un campione descrivono un campione di riferimento (una grande quantità di informazioni viene inclusa a partire dal campo fino all’imbottigliamento dell’olio), o un campione sperimentale (informazioni disponibili riguardanti un prodotto), inclusi i dati obbligatori/volontari menzionati nei regolamenti CE di interesse. È importante tenere in considerazione che oltre all'olio di oliva si possono registrare i dati anche altri oli commestibili. Potenzialmente tutti i metodi analitici possono essere gestiti con metadati appropriati, inclusi i metodi proposti nel progetto OLEUM, ma anche quelli utilizzati dagli Stati membri per verificare la conformità degli oli di oliva.
 

Il modulo di ricerca (Search tool) consente all'utente di cercare qualsiasi parola chiave nell'intero del Databank, in ciascuna delle diverse categorie di dati: documenti, campioni, set di campioni, esperimenti, risultati e tecniche. Questo strumento molto potente consente all'utente di esplorare i dati disponibili all’interno della banca dati. I risultati della ricerca sono presentati in una tabella modificabile, che consente di visualizzare i campi selezionati, di applicare filtri diversi, di dimensionare le colonne, di ordinare ogni campo, ecc. Il contenuto di ciascuna di tali tabelle può essere esportato come semplice file csv e analizzato sul PC dall'utente.
 

A breve, il Databank sarà aperto al pubblico e richiederà una registrazione per incrementare e valorizzare il database, al fine di dimostrare la capacità diagnostica dei metodi analitici selezionati di evidenziare eventuali adulterazioni o di dare informazioni importanti per il controllo di qualità dell’olio di oliva. A medio termine, a seconda dell'interesse degli organismi di controllo nazionali, l'accesso potrebbe essere limitato a questi ultimi per motivi di riservatezza.

Metodo rapido basato sulla spettroscopia a fluorescenza

Un metodo per la determinazione di composti lipofili bioattivi a struttura fenolica (tocoferoli o vitamina E)

Gli oli di oliva “freschi” contengono un contenuto variabile di tocoferoli, molecole lipofiliche fenoliche caratterizzate da attività antiossidante e vitaminica (nello specifico l’alfa-tocoferolo è la forma in grado di esercitare il ruolo di vitamina E).
 

Comunque, poiché questi composti sono suscettibili di ossidazione, la loro concentrazione tende a decrementare durante la conservazione del campione (in dipendenza dalle condizioni adottate e dalla naturale composizione dell’olio).
 

E’ possibile realizzare l’analisi in fluorescenza degli oli di oliva grazie alla presenza di alcuni componenti che fuorescono naturalmente (es. clorofilla e derivati) tra i quali i tocoferoli.
 

La scansione degli spettri di fluorescenza è stata realizzata mediante uno strumento dotato di un piatto auto-campionatore da 96 postazioni.
 

Le misurazioni (lunghezza d’onda di eccitamento a 302 nm e di emissione a 328 nm) sono state effettuate trasferendo direttamente piccoli quantitativi dei campioni di olio di oliva (250 µl) senza necessità di applicare trattamenti di preparazione del campione (come diluizioni o estrazioni, vedere lo schema riportato in Figura 1).
 

E’ stato evidenziato come i risultati ottenuti applicando la spettroscopia in fluorescenza siano altamente correlati con quelli del metodo di riferimento HPLC (vedere Figura 2) per la quantificazione del contenuto in alfa-tocoferolo.
 

Il metodo mediante spettroscopia in fluorescenza è stato “in-house” validato con successo (es. con riferimento a parametri quali precisione, accuratezza, LOD, LOQ, robustezza).
 

Il principale vantaggio di questo approccio risiede nella possibilità di effettuare uno screening di controllo estremamente rapido di un elevato numero di campioni di olio di oliva senza necessità di fasi specifiche di preparazione del campione.

Figura 1: Diagramma di flusso - 250 µl di ogni campione di olio di oliva sono trasferiti in un piatto auto-campionatore da 96 postazioni e direttamente analizzati mediante spettroscopia a fluorescenza.

Figura 2: Correlazione tra le concentrazioni di alfa-tocoferolo determinate con il metodo basato sulla spettroscopia a fluorescenza e quello di riferimento mediante HPLC-FLD.

Un sistema portatile funzionante a batteria per la determinazione dell’acidità libera dell’olio di oliva

La qualità dell’olio di oliva è influenzata da diversi fattori, tra cui il processo di estrazione e lo stato di maturazione del frutto, oltre alle condizioni di conservazione (luce e temperatura). Diversi parametri analitici (tra cui l’acidità libera e il numero di perossidi), in aggiunta ad una analisi sensoriale, vengono utilizzati per classificare la qualità di un olio di oliva. Il primo e più importante di tali parametri è l’acidità libera e il metodo ufficiale per la sua determinazione è una titolazione chimica che deve essere eseguita in laboratorio da personale specializzato.
 

Lo scopo di questo progetto è lo sviluppo di una tecnica innovativa per la determinazione dell’acidità libera dell’olio di oliva che possa essere facilmente implementata mediante un sistema elettronico portatile per effettuare misure rapide ed accurate direttamente sul campo da parte di personale non specializzato. Questo consente anche alle realtà produttive più piccole (frantoi e centri di impacchettamento),  che non possono permettersi un laboratorio interno per l’analisi di qualità, di effettuare in loco misure di acidità libera senza i costi e i lunghi tempi di risposta derivanti dalla spedizione dei campioni da analizzare a un laboratorio esterno.
 

Il metodo di misura implementato si basa sulla Spettroscopia di Impedenza, una tecnica in cui una tensione sinusoidale viene applicata al campione analizzato e le sue caratteristiche elettriche vengono determinate in un certo range di frequenze. Nel nostro caso il campione analizzato è una emulsione tra una soluzione idroalcolica (etanolo 60%, acqua distillata 40%) e il campione di olio di oliva. Una analisi preliminare è stata effettuata utilizzando un misuratore di impedenza commerciale (Agilent E4980A) nel range di frequenze 20 Hz – 2 MHz. I risultati hanno mostrato l’esistenza di una correlazione tra l’acidità libera del campione di olio di oliva e la conduttanza elettrica dell’emulsione misurata a basse frequenze (< 10 kHz).
 

Si è quindi passati allo sviluppo e alla costruzione di una strumento portatile per misure sul campo dell’acidità libera dell’olio di oliva. Lo strumento ha dimensioni 11 x 15 x 5 cm e può essere alimentato sia tramite una porta USB che con batterie (3 batterie alcaline da 1,5 V). La scheda elettronica al suo interno, basata sul microcontrollore STM32L152RCT6A prodotto da ST Microelectronics, integra uno schermo LCD per la visualizzazione dei risultati della misura, quattro tasti per l’interazione con l’utente e tutta l’elettronica necessaria per effettuare le misure elettriche (misure di conduttanza elettrica a 200 Hz). L’emulsione (15 mL di soluzione idroalcolica e 1 mL di olio di oliva) è contenuta all’interno di una provetta Falcon da 50 mL opportunamente modificata con una coppia di elettrodi semisferici in acciaio inox (diametro 6 mm, separati da 12 mm) per la misura delle caratteristiche elettriche. Lo strumento è stato calibrato e le curve di calibrazione memorizzate nella memoria non volatile del microcontrollore. Lo strumento permette di effettuare misure di acidità libera su campioni di olio di oliva con tempi di risposta dell’ordine di 30 secondi.
 

Al termine della calibrazione, il sistema è stato validato in laboratorio eseguendo misure su un set di 30 campioni di olio di oliva di origine geografica diversificata, caratterizzati da valori dell’acidità libera compresi tra 0,18 e 4,5 (Grossi, M.; Palagano, R.; Bendini, A.; Riccò, B.; Servili, M.; García-González, D. L.; Toschi, T. G.; Design and in-house validation of a portable system for the determination of free acidity in virgin olive oil. Food Control, 2019, 104, 208-216). L’accuratezza dello strumento è stata valutata confrontando i risultati dello strumento con quelli dell’acidità libera ottenuta mediante il metodo ufficiale. Si è ottenuta una buona correlazione con il metodo ufficiale  (R_adj = 0.97) e risultati soddisfacenti sono stati ottenuti per quanto riguarda i parametri LOD, LOQ, precisione e accuratezza. 

Studi di validazione inter-laboratorio

Paul Brereton (Queen’s University Belfast)
 

Nelle fasi mesi finali delle attività del progetto OLEUM tutti i partner si trovano estremamente impegnati nell’analisi dei molti dati prodotti, considerando che si sta completando uno dei più grandi studi inter-laboratorio del mondo.
 

In effetti, si tratta di un insieme di studi di validazione, che ha coinvolto 8 diversi metodi analitici con circa 15 laboratori partecipanti per ogni metodo ed ha previsto l’analisi di 10 campioni ciascuno, producendo più di mille dati. Inoltre, un ulteriore aspetto da considerare per ogni metodo è il numero di analiti da esaminare: alcuni ne prevedono due, ma per esempio, i due metodi di determinazione dei composti volatili ne prevedono addirittura 18. Il che porta a oltre 5000 risultati da analizzare!
 

I metodi che sono stati studiati sono:
 

     1. Analisi dei composti fenolici polari (i.e. polifenoli) utilizzata per valutare la possibile apposizione in etichetta dell’health claim per l’olio di oliva

     2. Analisi degli steroli liberi ed esterificati per evidenziare eventuali miscele fraudolente all’olio di oliva

     3. Metodologia revisionata per la determinazione quantitativa degli esteri etilici degli acidi grassi utilizzati come marcatori di miscele 
         fraudolente e di oli di oliva vergini di qualità inferiore

     4. Una serie di metodi per l’analisi sensoriale e dei composti volatili per la qualità e l'autenticità degli oli vergini di oliva

          a. Analisi di composti volatili selezionati negli oli vergini di oliva mediante gascromatografia mediante due rivelatori:

               i. GC-MS

               ii. GC-FID

          b. Analisi di tipo fingerprint della frazione volatile degli oli vergini di oliva mediante SPME-GC-MS e chemiometria, proposto come metodo di screening a supporto del Panel test

          c. Analisi sensoriale degli oli vergini di oliva con l'utilizzo di due materiali di riferimento (rispettivamente “rancido” ed “avvinato”)

I metodi sopracitati prevedono aggiunte o miglioramenti dei metodi già esistenti, come i metodi 2 e 3, ma anche procedure innovative e avanzate multi-analita che mirano, ad esempio, a supportare il Panel Test (analisi sensoriale).

A seguito di uno studio preliminare condotto nella prima metà del 2020, che rappresenta la maggior parte dell’indagine, nell'autunno del 2020 si sono svolti i cosiddetti "Trial Proper" ossia i ring test utili per gli studi di validazione. Per ciascuno dei metodi sopra indicati a ciascun laboratorio partecipante è stata inviata una Procedura Operativa Standard (SOP) da seguire e degli specifici campioni (di solito 10 e un campione di prova con un valore noto) da analizzare una sola volta. All'insaputa dei partecipanti, i campioni da valutare consistevano in realtà di 5 campioni in duplicato che hanno consentito di calcolare la precisone all'interno del laboratorio e tra laboratori. Considerando che l’analisi statistica dei dati ottenuti è stata effettuata secondo standard riconosciuti a livello internazionale, i metodi studiati possono quindi essere valutati per l'idoneità come metodi ufficiali.
 

I risultati ufficiali saranno resi disponibili dopo essere stati condivisi con i partecipanti e una volta che il progetto sarà ufficialmente chiuso. Alcune delle procedure verranno poi proposte come metodi ufficiali al Consiglio Oleicolo Internazionale ed alla Commissione Europea.
 

Cogliamo l'occasione per ringraziare tutti i laboratori che hanno partecipato a questo grande progetto, tenendo in considerazione anche le circostanze estremamente difficili causate dalla pandemia attualmente in corso che ha investito in pieno i mesi dedicati alla validazione.

La rivoluzione dei controlli di qualità ed autenticità in OLEUM

Dalla sostenibilità ai big data per la conformità

Tullia Gallina Toschi
 

Il progetto OLEUM si è concluso con la conferenza pubblica finale che si è tenuta il 17 e 18 febbraio ei video sono disponibili sul sito web del progetto. Gli obiettivi del progetto erano pragmatici. OLEUM non voleva indagare i possibili marcatori di qualità degli oli di oliva in modo estensivo a prescindere dai costi e dalla disponibilità reale degli strumenti. OLEUM voleva identificare nuovi metodi applicabili nelle condizioni in essere nei laboratori di controllo o ridurre i tempi, l’uso dei solventi o dei consumabili dei metodi già legalmente riconosciuti. Le parole chiave erano quindi rinnovare o rivedere. Oggi è dunque chiaro il legame del progetto con gli elementi fondanti della sostenibilità. La proposta di ricerca di OLEUM, inviata alla Commissione il 26 giugno 2014, anticipava ad esempio alcuni target dell’obiettivo 12 dell’agenda 2030, adottata dall’ONU nel settembre 2015, come la necessità di ridurre il rilascio, il mancato riciclo o lo spreco di sostanze chimiche (target 12.4) e da questo punto di vista l’approccio di OLEUM può essere esteso a molti altri alimenti.
 

L’altro aspetto fondante del progetto era il connubio tra prevenzione e controllo. I portatori di interesse della qualità di un alimento così prezioso come l’extra vergine di oliva sono stati messi allo stesso tavolo. Piccoli o medi produttori primari, che desiderano che l’olio sia giustamente remunerato, grandi produttori o imbottigliatori, che hanno bisogno di un ulteriore margine e che devono necessariamente proporre al mercato diverse qualità e prezzi, ma che non vogliono più trovarsi in condizioni di non conformità e al di sotto della qualità legale e laboratori pubblici di controllo che devono e vogliono effettuare i controlli con metodi altamente diagnostici, robusti, rapidi, efficaci su tutti i territori ed armonizzati. Ed infine, last but not least, chi consuma, che deve essere edotto su un prodotto molto utilizzato ma poco noto nella sostanza, e che vuole garanzie di qualità. OLEUM si è mosso in due direzioni, quella di sviluppare metodi di screening rapidi utili per la prevenzione, per il controllo di qualità in azienda, ma strettamente correlati ai metodi ad alta sensibilità e specificità da proporre ai tavoli di normazione per l’adozione nei controlli pubblici di qualità.
 

Uno dei problemi era la qualità sensoriale. Essa rappresenta uno dei tre pilastri fondanti della qualità dell’EVOO, insieme agli elementi stringenti di “freschezza” (definibile come qualità dell’olio al tempo zero) e all’integrità delle olive di partenza. La specificità tecnologica, l’essere quindi un prodotto solo spremuto, centrifugato e filtrato, ossia non raffinato, è una qualità importante ma è condivisa con l’olio vergine (VOO) che non presenta determinanti così rigorosi delle precedenti qualità. Senza qualità sensoriale ineccepibile l’EVOO non esisterebbe seppure questo elemento resti uno dei più difficili da attestare. È cosa nota che la maggior parte delle non conformità riguarda gli aspetti sensoriali. OLEUM per questo, giovandosi di tutta la letteratura sull’argomento, ha messo a punto e validato due metodi cromatografici ad alta risoluzione (SPME-GC/MS ed SPME-GC/FID) destinati ai laboratori pubblici di controllo che verranno portati al tavolo del Consiglio Oleicolo Internazionale così da poter essere adottati una volta che si stabiliranno limiti ed intervalli per i marcatori più rilevanti. Questi metodi potranno affiancarsi al Panel test, ossia alla valutazione sensoriale, in caso di classificazioni dubbie. 
 

In parallelo, le stesse leve, ossia il numero minimo di composti volatili ritenuti altamente diagnostici (15-18 composti) sono stati utilizzati per proporre metodi rapidi di screening in grado, per esempio, di pre-classificare il prodotto EVOO sulla base della qualità sensoriale. Questi metodi saranno soprattutto utili per chi imbottiglia per decidere rapidamente se acquistare o meno una partita di olio.
 

La scommessa di OLEUM, che ha anche creato un Network internazionale, che riunisce i portatori di interesse, allarga la conoscenza sull’olio di oliva e sull’EVOO, fa della competitività sul prodotto e sui metodi di controllo una leva positiva. Si tratta di leve di autenticità e qualità partecipate, che isolano solo i frodatori, non nutrono le catene di promozione negativa e gli “hater” del prodotto, ma invece sono volte a dare, nella pratica, ulteriori elementi di certezza. 
 

Non mi soffermo infine sulle tante direzioni nelle quali si è mosso il progetto per la ricerca di nuovi marcatori e nuovi metodi. Posso solo rimandare alla pagina del sito web che riporta tutte le pubblicazioni edite fino ad ora e disponibili in open access e sottolineo che OLEUM si è concentrato anche nella direzione lungimirante di proporre, per la prima volta, la validazione di un metodo non targeted ossia che non utilizza singoli marcatori o traccianti ma tutto il tracciato o parti di esso.
 

È poi fondamentale citare il tanto lavoro di ricerca che ha portato all’implementazione di materiali di riferimento (RMs). Ne sono stati prodotti e validati quattro. Due materiali sensoriali, il rancido e l’avvinato e due standard per composti volatili da utilizzare come materiale di calibrazione strumentale. Sono tutti pronti per il mercato. Anche in questo caso il controllo di qualità dell’olio di oliva può fare da apripista ad un mercato alimentare più vasto.
 

Per concludere e per cercare di fornire una direzione strategica al futuro dei controlli di qualità ed autenticità dell’olio di oliva alcune direzioni promettenti per l’Europa potrebbero essere:
 

1. una strategia comune per combinare dati sensoriali e strumentali (ora una più semplice quantificazione di specifici composti volatili è possibile!), utile in caso di disaccordo tra due panel;
2. un miglioramento delle competenze e dell'allineamento di tutti i panel mediante una reciproca calibrazione, possibile in un futuro prossimo se sul mercato saranno disponibili dei materiali di riferimento riproducibili (RM);
3. composizioni conformi reali e virtuali progressivamente archiviate e implementate (per quanto riguarda quelle virtuali) all’interno di un repository di dati convalidati (es. OLEUM Databank) da utilizzare come riferimento per l’autenticità;
4. informazioni di qualità e autenticità relative all’OO da mettere in relazione con i quantitativi prodotti e la sua geolocalizzazione. L'intersezione tra controlli di qualità ufficiali e tracciabilità, tipica di uno scenario blockchain, potrebbe essere la prossima contromisura da adottare contro le frodi.

Mettendo insieme marcatori singoli, utili per il controllo della qualità e dell’autenticità dell’olio di oliva e dati riferiti all’intero profilo analitico siamo arrivati a possedere una visione d'insieme molto dettagliata, che si potrebbe descrivere come una fotografia o una immagine “biometrica”. Si trattava di una sfida difficile, che OLEUM è riuscito a vincere con un approccio incrementale, semplice e robusto, mettendo a punto e selezionando gradualmente nuovi elementi diagnostici per arrivare ad una sintesi efficace priva di ogni facile sensazionalismo.

Το τελικό συνέδριο OLEUM

Στις 17 και 18 Φεβρουαρίου 2021, το έργο OLEUM πραγματοποίησε με επιτυχία το τελικό του συνέδριο. Συνολικά, πάνω από 400 άτομα από διαφορετικά πεδία εγγράφηκαν στη διαδικτυακή συνάντηση για να ανακαλύψουν τα αποτελέσματα του έργου και να συζητήσουν τις μελλοντικές δυνατότητες διασφάλισης της ποιότητας και της αυθεντικότητας του ελαιόλαδου.

Η εκδήλωση χωρίστηκε σε δύο ημέρες με την πρώτη ημέρα να στοχεύει στα αποτελέσματα και τις επιπτώσεις του OLEUM στο μέλλον των ευρωπαϊκών πολιτικών για το ελαιόλαδο και τη δεύτερη ημέρα να επικεντρώνεται στα πρόσφατα αναπτυγμένα εργαλεία και μεθόδους ανάλυσης για την περαιτέρω διασφάλιση της ποιότητας και της αυθεντικότητας του ελαιόλαδου.

Ο καθηγητής Giovanni Molari, Επικεφαλής του Τμήματος Γεωπονικών Επιστημών και Επιστημών Τροφίμων στο Πανεπιστήμιο της Μπολόνια, καλωσόρισε τους παρευρισκόμενους προτού η συντονίστρια του έργου καθηγήτρια Δρ Tullia Gallina Toschi δώσει μια περίληψη για τα πιο σημαντικά αποτελέσματα του έργου OLEUM. Όπως δήλωσε, οι ευκαιρίες που προκύπτουν από τα αποτελέσματα έχουν μεγάλο ενδιαφέρον και είναι εξαιρετικά πολύτιμα για την αγορά. Τα αποτελέσματα που προσφέρει το έργο OLEUM λαμβάνονται επίσης υπόψη για την ανάπτυξη μελλοντικών πολιτικών της ΕΕ για το ελαιόλαδο.

"Πρέπει να διαδραματίσουμε διαμορφωτικό ρόλο στο τι είναι το ελαιόλαδο και τι είναι το EVOO." - Καθηγήτρια Δρ Tullia Gallina Toschi

Το διεθνές και συνεχώς αναπτυσσόμενο δίκτυο OLEUM συγκεντρώνει και διευρύνει την υψηλής ποιότητας εμπειρία στην ανάλυση και τον έλεγχο ταυτότητας των ελαιόλαδων. Έτσι, οδηγούμαστε σε νέα και καινοτόμα εργαλεία και μεθόδους για την εξάλειψη των παράνομων δραστηριοτήτων και την προστασία της ποιότητας του ελαιόλαδού. Τα ευρήματα από αυτές τις μεθόδους μπορούν να αποθηκευτούν στην τράπεζα δεδομένων OLEUM, η οποία είναι ένα από τα βασικά αποτελέσματα του έργου και βοηθά στη βελτίωση της ανταλλαγής πληροφοριών μεταξύ διαφόρων ενδιαφερόμενων μερών της κοινότητας του ελαιολάδου. Λόγω των πολλών λανθασμένων πληροφοριών σχετικά με το ελαιόλαδο από διάφορες πηγές, είναι σημαντικό μέρος του έργου να παρέχει αξιόπιστες και επιστημονικές πληροφορίες στο κοινό, γι’ αυτό το τμήμα επικοινωνίας του έργου OLEUM έχει μεγάλη σημασία.

Οι αντίστοιχες μέθοδοι εισήχθησαν και εξηγήθηκαν από τους προγραμματιστές τους τη δεύτερη ημέρα του τελικού συνεδρίου OLEUM. Οι συμμετέχοντες έλαβαν μια εικόνα για το τεχνικό υπόβαθρο και είχαν τη δυνατότητα να διευκρινίσουν ερωτήσεις από τους προγραμματιστές σε μια συνεδρία ερωτήσεων και απαντήσεων.

Τα σχόλια στο τέλος του συνεδρίου, καθώς και στη συνομιλία και μέσω των κοινωνικών μέσων μαζικής ενημέρωσης ήταν υπέροχα και η ομάδα OLEUM θα ήθελε να ευχαριστήσει όλους τους παρευρισκόμενους και τους ομιλητές που το έκαναν δυνατό!

Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα κύρια αποτελέσματα του έργου, τις ηχογραφήσεις του τελικού συνεδρίου και άλλους πόρους, ανατρέξτε στο εικονικό πακέτο που ετοιμάσαμε για εσάς: Κάντε κλικ εδώ

Μπορείτε να βρείτε το βιντεοσκοπημένο τελικό συνέδριο εδώ!

Το Δίκτυο OLEUM

Tassos Koidis, Paul Breton και Enrico Valli
 

Στον χρόνο που μεσολάβησε από την τελευταία μας επικοινωνία, το Δίκτυο OLEUM αναπτύσσεται σταθερά, ως προς το περιεχόμενο αλλά και τον αριθμό μελών του. Έχουμε πλέον 120 μέλη στην πλατφόρμα Basecamp του OLEUM (αύξηση 18%) και 164 μέλη (21%) στο OLEUM «Ερώτηση του Μήνα», το δίκτυό μας στο LinkedIn. Έχουμε δημοσιεύσει 3 επιπλέον Ερωτήσεις & Απαντήσεις (Ε1: Αλήθεια ή ψέμα; Η θέρμανση του ελαιολάδου οδηγεί στην παραγωγή τρανς λιπαρών οξέων. Ε2: Τί είναι το έλαιο ρεμολίντο; Ε3: Είναι το EVOO ψυχρής έκθλιψης πάντα ανώτερο του κανονικού VOO;). 

Ήταν μια πολυάσχολη περίοδος για κάποια από τα μέλη του OLEUM που πραγματοποιούν μελέτες επικύρωσης μεθόδων, οι οποίες ολοκληρώθηκαν λίγο πριν τα Χριστούγεννα. Τα μέλη που εργάζονται σε ιδιωτικά και δημόσια εργαστήρια δοκιμών, όπως ο Jorge από το Sovena βρήκαν ιδιαίτερα χρήσιμο το ότι μπορούσαν να έχουν ελεύθερη πρόσβαση στο εκπαιδευτικό υλικό των δύο εργαστηρίων OLEUM που πραγματοποιήθηκαν στην Ισπανία (Οκτ. 2019) και την Ιταλία (Δεκ. 2019), μέσω των πόρων του Δικτύου OLEUΜ. Ακόμα, το τελευταίο διάστημα, εντάχθηκαν στο δίκτυο πολλοί νέοι φοιτητές, όπως η Gabriela από το Πανεπιστήμιο της Κόρδοβα στην Ισπανία, η οποία και έγραψε: «Χρειαζόμουν πληροφορίες σχετικά με το ελαιόλαδο στα πλαίσια της προετοιμασίας μου για το τελευταίο έτος της μεταπτυχιακής μου διατριβής, και ειδικότερα σχετικά με την τεχνική της αέριας χρωματογραφίας για την ταξινόμηση του ελαιολάδου σε τρεις κατηγορίες, εξαιρετικά παρθένο, παρθένο και λαμπάντε. Τελείωσα την εργασία μου τον Οκτώβριο του 2020, αλλά αυτήν την στιγμή περιμένω την αξιολόγησή μου για ένα διδακτορικό πρόγραμμα του ιδίου πανεπιστημίου». Από την πρόσφατη ανακοίνωση σχετικά με το Τελικό Συνέδριο OLEUM, τα Δίκτυα λαμβάνουν επίσης την προσοχή πολλών ατόμων, μέσω καθημερινών νέων εγγραφών. Εμείς, οι άνθρωποι του έργου OLEUM, έχουμε πολλές ιδέες σχετικά με το μέλλον του Δικτύου OLEUM και την πορεία του μετά την επίσημη ολοκλήρωση του έργου. Αλλά πρώτον και κυριότερο, θα θέλαμε να ακούσουμε τη γνώμη σας. Γίνετε μέλος του Δικτύου (για το LinkedIn ακολουθήστε τον σύνδεσμο). Αν ενδιαφέρεστε να μάθετε τί συζητήθηκε στο τελικό συνέδριο OLEUM σχετικά με τις επόμενες κινήσεις του Δικτύου, παρακαλούμε αναζητήστε την ηχογράφηση του συνεδρίου εδώ.  

Δύο δείγματα αναφοράς για την οργανοληπτική αξιολόγηση

Καθ. Alessandra Bendini, Δρ. Diego Luis Garcia Gonzalez, Καθ. Tullia Gallina Toschi
 

Στην περίπτωση του παρθένου ελαιολάδου, η οργανοληπτική αξιολόγηση είναι η πρότυπη μέθοδος και, σύμφωνα με τους κανόνες του Διεθνούς Συμβουλίου Ελαιολάδου (ΔΣΕ) και άλλους εθνικούς και διεθνείς κανονισμούς (Κανονισμοί της ΕΕ, Διατροφικός Κώδικας) η εφαρμογή της είναι υποχρεωτική για την καθιέρωση πιθανών κατηγοριών ποιότητας (λ.χ. για την ΕΕ: εξαιρετικά παρθένο, παρθένο, λαμπάντε) καθώς και για την προώθηση του προϊόντος.  
 

Τα εργαστήρια που εφαρμόζουν τις αναλυτικές μεθόδους, πρέπει να καταδεικνύουν την ικανότητά τους στην εφαρμογή των μεθόδων οργανοληπτικής αξιολόγησης, ακολουθώντας τις διαδικασίες που περιγράφονται από την ΕΕ και το ΔΣΕ, με δοκιμές που διασφαλίζουν την εγκυρότητα των αποτελεσμάτων: αυτή η διεργασία επικύρωσης πρέπει να διεξάγεται με Δείγματα Αναφοράς (RMs). Στην πραγματικότητα, η χρήση των RMs αναφέρεται στους ισχύοντες κανονισμούς ως αναγκαία για την οργανοληπτική ανάλυση (COI/T.28/Doc.no.1/Rev.4; COI/T.20/Doc. no.14/Rev.5). 
 

Η χρήση των δειγμάτων αναφοράς (RMs), οι οριστικές αριθμητικές τιμές των οποίων μπορούν να συσχετιστούν με τα διαφορετικά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, είναι απολύτως αναγκαία για την βαθμονόμηση της διαδικασίας μέτρησης, για να βοηθηθούν οι αξιολογητές στην απομνημόνευση των οργανοληπτικών ερεθισμάτων, καθώς και για να συγκριθεί η κρίση τους με τις «καθορισμένες τιμές», βελτιώνοντας έτσι τις ατομικές τους ικανότητες. Για τους λόγους αυτούς, τα RMs θα πρέπει να εφαρμόζονται για τη συνεχή παρακολούθηση των πάνελ οργανοληπτικής αξιολόγησης, τόσο σε βάθος χρόνου όσο και για τις μελέτες ελέγχου εντός και μεταξύ των πάνελ. Επιπρόσθετα, τα RMs θα μπορούσαν να είναι ιδιαίτερα χρήσιμα για την επιλογή και την κατάρτιση των νέων αξιολογητών που προσλήφθηκαν κατά την διάρκεια των πολυάριθμων προγραμμάτων που οργανώθηκαν σε εθνικό και διεθνές επίπεδο από διαφορετικούς οργανισμούς, και τα οποία διερεύνησαν τον συγκεκριμένο σχεδιασμό των μελών των πάνελ οργανοληπτικής αξιολόγησης των παρθένων ελαιολάδων.
 

Για την οργανοληπτική ανάλυση των VOOs, επί του παρόντος είναι διαθέσιμα για την εκπαίδευση των οργανοληπτικών πάνελ μόνο RMs από φυσικούς πίνακες (αυθεντικά ελαιόλαδα που χρησιμοποιούνται ως δείγματα αναφοράς για οργανοληπτικά ελαττώματα που παρέχονται από το ΣΔΕ, δείγματα από δοκιμές επάρκειας ή πιστοποιημένα από τουλάχιστον τρία διαπιστευμένα οργανοληπτικά πάνελ). Αυτά τα δείγματα αναφοράς είναι αποτελεσματικά διότι είναι όμοια με τα πραγματικά δείγματα, αν και έχουν κάποιους περιορισμούς όσον αφορά τη χρήση τους σε βάθος χρόνου (λ.χ. περιορισμένη διαθεσιμότητα, δυσκολία στην απόκτηση, χαμηλός βαθμός ομοιογένειας από έτος σε έτος). 
 

Τα RMs που μιμούνται τα κρασώδες-ξυδάτο άρωμα και το ταγγό ελάττωμα, έχουν παρασκευαστεί σε συγκεκριμένες αραιώσεις από το CSIC, χρησιμοποιώντας μία συλλογή συνθετικών πτητικών ενώσεων διαλυμένων σε εξευγενισμένο ελαιόλαδο με ουδέτερη γεύση σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις (Aparicio-Ruiz et al., 2020, Foods, 9(12), 1870). Έπειτα το UNIBO συντόνισε την οργανοληπτική αξιολόγησή τους εντός της κοινοπραξίας OLEUM (συμμετείχαν έξι πάνελ αξιολόγησης) καθώς και στα πλαίσια της διεργαστηριακής επικύρωσης που μόλις ολοκληρώθηκε (προ-δοκιμαστικό στάδιο και στάδιο τελικής δοκιμής). 
 

Τα κύρια αποτελέσματα της διεργαστηριακής επικύρωσης ήταν τα εξής: 
 

Η αξιολόγηση της αντιπροσωπευτικότητας των δειγμάτων αναφοράς (RM1 και RM2), όσον αφορά την εκτίμηση των μελών του πάνελ αξιολόγησης σχετικά με την «χρησιμότητά τους στο να μοιάζουν με τα φυσικά οργανοληπτικά ελαττώματα κρασώδες-ξυδάτο και ταγγό»: τα δεδομένα που ελήφθησαν κατέδειξαν πως τα RMs αποτιμήθηκαν ως κατάλληλα από υψηλό ποσοστό των τελικών χρηστών. 
 

Ο υπολογισμός των αντιληπτών εντάσεων του κρασώδους-ξυδάτου και του ταγγού ελαττώματος (RM1 και RM2), διότι ο ορισμός της έντασης κάθε οργανοληπτικού RM αποτελεί θεμελιώδη πληροφορία που θα επιτρέψει την πιθανή μελλοντική χρήση στην εκπαίδευση των αξιολογητών: επιτεύχθηκε η ευθυγράμμιση μεταξύ των πάνελ αξιολόγησης όσον αφορά την ένταση του ελαττώματος στο κάθε RM.   

Λογισμικό για τον υπολογισμό της ημερομηνίας «ελάχιστης διατηρησιμότητας» του Εξαιρετικά Παρθένου Ελαιολάδου

Από τον Maurizio Servili και την Tullia Gallina Toschi

Το επίπεδο και ο βαθμός υποβάθμισης της ποιότητας του EVOO, επηρεάζονται σε μεγάλο βαθμό από την χημική σύσταση και τις συνθήκες αποθήκευσης (συσκευασία, θερμοκρασία και έκθεση στο φως) και έχει τεκμηριωθεί σε βάθος, πως είναι εξαιρετικά μεταβλητά ανάλογα με αυτούς τους παράγοντες. Η ημερομηνία ελάχιστης διατηρησιμότητας (BBD) για την κατανάλωση ενός EVOO που αναφέρεται πάνω στην ετικέτα του προϊόντος (δηλαδή η ελάχιστη περίοδος αποθήκευσης κατά την οποία τα ελαιόλαδα διατηρούν τις χημικές και οργανοληπτικές τους παραμέτρους εντός της αντίστοιχης κατηγορίας που δηλώθηκε), εξαρτάται από τον παραγωγό. Η μόνη άλλη αντικειμενική πληροφορία σχετικά με την “ηλικία” του ελαιολάδου που μπορεί να αναφερθεί γραπτώς (αν το 100% του περιεχομένου του δοχείου προέρχεται από την ίδια συγκομιδή), είναι το έτος συγκομιδής (ή ο μήνας). 

Πώς δύνανται οι παραγωγοί να παρέχουν σε επιστημονική βάση, μία αξιόπιστη BBD για το EVOO τους, όταν προς το παρόν δεν υπάρχουν αντικειμενικές μέθοδοι για να προσανατολιστούν; Η διαθεσιμότητα ενός εργαλείου για τον προσδιορισμό της BBD και η προληπτική του χρήση θα ήταν η καλύτερη τακτική άμυνας ενάντια στην απώλεια της εμπιστοσύνης του καταναλωτή και ενάντια στον κίνδυνο καταγγελιών περί απάτης.   

Για να συμπληρώσει αυτό το κενό, στο πλαίσιο του έργου Oleum, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε ένα λογισμικό ικανό να προβλέψει την BBD ενός ορισμένου EVOO σε καθορισμένες συνθήκες αποθήκευσης. 

Για την επίτευξη του τελικού στόχου, κατασκευάστηκαν μοντέλα πρόβλεψης με βάση μία μεγάλη αναλυτική βάση δεδομένων, και τα οποία παρήχθησαν ακολουθώντας την εξέλιξη των επιλεγμένων αναλυτικών παραμέτρων, σε ένα πείραμα διάρκειας διατήρησης του αναλώσιμου προϊόντος σε πραγματικό χρόνο σε 20 δείγματα EVOO. Τα δείγματα επιλέχθηκαν σύμφωνα με τον σχεδιασμό καταλληλότητας με βάση την ορίζουσα (D-optimal) και χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο περισσότερο περιγραφικής ένωσης (MDC), έτσι ώστε να καλυφθεί η πειραματική περιοχή με έλαια που χαρακτηρίζονται από συνδυασμούς χαμηλής, μεσαίας και υψηλής συγκέντρωσης των επιλεγμένων λιπαρών οξέων, υδρόφιλων φαινολών και τοκοφερολών.     

Αυτά τα 20 δείγματα EVOO χαρακτηρίστηκαν αναλυτικά πλήρως ως προς τις νόμιμες παραμέτρους ποιότητας, το προφίλ λιπαρών οξέων, τα αντιοξειδωτικά (υδρόφιλες φαινόλες και τοκοφερόλες), τα DAGs και το OSI, έπειτα εμφιαλώθηκαν σε φιάλες με γυαλί βαθμού UVA, τοποθετήθηκαν σε ράφια για 12 μήνες με έκθεση στο φως (για 12 ώρες ανά μέρα στους 25°C) και παράλληλα για 24 μήνες στο σκοτάδι (25-30-35 °C). Πραγματοποιούνταν δειγματοληψίες και αναλύσεις σε μηνιαία βάση για την έκθεση στο φως και κάθε δύο μήνες για τις συνθήκες στο σκοτάδι.  

Οι παράμετροι που αναλύθηκαν κατά την κατασκευή του μοντέλου διάρκειας διατήρησης του αναλώσιμου προϊόντος σε πραγματικό χρόνο ήταν οι εξής: οξύτητα, αριθμός υπεροξειδίων, K232, K270, ∆K, υδρόφιλες φαινόλες, α-τοκοφερόλη, πτητικές ενώσεις και η σύσταση σε λιπαρά οξέα. 
 

Ολόκληρο το σύνολο των δεδομένων που ελήφθησαν από τις αναλύσεις, χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή δύο διαφορετικών προγνωστικών μοντέλων, ένα 
για την έκθεση στο φως και ένα για τις συνθήκες αποθήκευσης στο σκοτάδι.
 

Αυτά τα προγνωστικά μοντέλα κατασκευάστηκαν με πολυμεταβλητή στατιστική προσέγγιση και μέσω των δύο μοντέλων συνήχθησαν οι συντελεστές για τον υπολογισμό του χρόνου που υπολείπεται για την επίτευξη των οριακών τιμών των επιλεγμένων ποιοτικών παραμέτρων σύμφωνα με τη νομοθεσία, έτσι ώστε να προσδιοριστούν οι BBDs.
 

Η προγνωστική ικανότητα επικυρώθηκε εσωτερικά και εξωτερικά, επιδεικνύοντας ικανοποιητική ακρίβεια στην πρόβλεψη της ημερομηνίας κατά την οποία θα ξεπεραστούν το ανώτατο όριο σημαντικότερων ποιοτικών παραμέτρων, αλλά εκείνων που προβλέπονται από τη νομοθεσία (όσον αφορά την σταθερά K270, τη συγκέντρωση των υδρόφιλων φαινολών και το όριο που οι πτητικές ενώσεις οδηγούν στην αίσθηση του ελαττώματος του ταγγού).
 

Το λογισμικό αναπτύχθηκε ώστε να είναι φιλικό προς τον χρήστη, έτσι ώστε τα στοιχεία που εισάγονται για την πρόβλεψη της BBD για ένα ορισμένο EVOO είναι: όνομα δείγματος, συνθήκες αποθήκευσης (φως/σκοτάδι και θερμοκρασία) και μία επιλογή αναλυτικών παραμέτρων. Το αποτέλεσμα δίνεται ως ο χρόνος που χρειάζεται για να ξεπεραστεί η οριακή τιμή (σε μήνες). Η ακρίβεια πρόβλεψης της BBD είναι ικανοποιητική για τον σκοπό του να παρέχει στον παραγωγό ένα εργαλείο που χρειάζεται και για να ενισχύσει την εμπιστοσύνη του καταναλωτή.  

Πρότυπα διαλύματα που θα χρησιμοποιηθούν στην ανάλυση των πτητικών ενώσεων

Τα θετικά και τα αρνητικά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά στα παρθένα ελαιόλαδα (VOOs) εξαρτώνται αυστηρά από την σύνθεση των πτητικών κλασμάτων. Έως σήμερα, η οργανοληπτική αξιολόγηση των VOOs, όσον αφορά την παρουσία και την ένταση των οργανοληπτικών αυτών χαρακτηριστικών, πραγματοποιείται σύμφωνα με την μέθοδο που είναι γνωστή ως πάνελ Οργανοληπτικής αξιολόγησης. Δεδομένης της πιθανής ασυμφωνίας στην ταξινόμηση των VOOs μεταξύ διαφορετικών πάνελ αξιολόγησης, είναι μεγίστης σημασίας η επιβεβαίωση/διάκριση που προκύπτει από την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση συγκεκριμένων πτητικών οργανικών ενώσεων (VOCs), οι οποίες είναι υπεύθυνες για τα ελαττώματα ή τα θετικά χαρακτηριστικά.

Στο πλαίσιο αυτό, το έργο OLEUM πρότεινε μεθόδους για την ανάλυση των πτητικών ενώσεων στα VOOs με βάση διαφορετικές αναλυτικές τεχνικές: από τις πλέον εδραιωμένες SPME-GC-FID και SPME-GC-MS στην πιο καινοτόμα HS-GC-IMS, η τελευταία είναι πιο προσαρμοστική στον έλεγχο, ο οποίος πραγματοποιείται για την ταξινόμηση των VOOs στην αντίστοιχη κατηγορία ποιότητας (εξαιρετικά παρθένο, παρθένο και λαμπάντε). Μία ποιοτική και ποσοτική οργανοληπτική ανάλυση των πτητικών ενώσεων μπορεί να λειτουργήσει συμπληρωματικά στην οργανοληπτική αξιολόγηση και επιπλέον, μόλις επικυρωθούν τα σήματα/δείκτες, να καθορίσει τα όρια συγκέντρωσης των σχετικών ενώσεων, για τους διαφορετικούς βαθμούς ποιότητας. Με βάση τις αναλυτικές έρευνες που πραγματοποιήθηκαν στα πλαίσια του έργου OLEUM, επιλέχθηκαν 18 πτητικές ενώσεις με στόχο την ευρεία διάθεση στο εμπόριο ενός σετ προτύπων με ελάχιστο αριθμό ενώσεων με υψηλή διαγνωστική αξία. Αυτές ομαδοποιήθηκαν σε δύο Πρότυπους Πίνακες (SMA και SMB) και προστέθηκαν σε εξευγενισμένο ελαιόλαδο, για να μειωθεί δραστικά ο αριθμός των αναλύσεων κατά την προετοιμασία των καμπύλων βαθμονόμησης. Η επιλογή των 18 πτητικών ενώσεων στους πίνακες SMA ή SMB έγινε βάση: i) της συνήθους ύπαρξής τους στα VOOs (υψηλή η χαμηλή συγκέντρωση) και ii) βάση της ανάγκης περιορισμού των πιθανών επικαλύψεων μεταξύ των ενώσεων, διευκολύνοντας έτσι την διεργαστηριακή σύγκριση των αποτελεσμάτων, η οποία σε αντίθετη περίπτωση θα δυσκόλευε την διάκριση των κορυφών. 

Τα ίδια μείγματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν επίσης ως δείγματα βαθμονόμησης για την ανάπτυξη ταχέων μεθόδων ελέγχου. Όπως δημοσιεύτηκε πρόσφατα στο περιοδικό Foods  τουλάχιστον 15 από τις 18 πτητικές ενώσεις μπορούν να υποστούν έκλουση και να ανιχνευτούν με την μέθοδο HS-GC-IMS. Η σύνθεση αυτών των πινάκων έχει παρουσιαστεί σε ορισμένες δημόσιες εκδηλώσεις και περιγράφεται λεπτομερώς σε ένα άλλο επιστημονικό άρθρο που δημοσιεύτηκε στο περιοδικό Food Control.

Οργανολογία που βασίζεται στην τεχνική TDR, χρήσιμη για τον εντοπισμό μειγμάτων  EVOOs με ήπια αποσμημένα ελαιόλαδα

Η Ανάκλαση Περιοχής του Χρόνου (TDR) είναι μία γνωστή τεχνική που χρησιμοποιείται σε πολλά πεδία: στον έλεγχο ασυνεχειών σε ηλεκτρικές γραμμές, στην εξακρίβωση της υγρασίας εδάφους και στον διηλεκτρικό χαρακτηρισμό τροφίμων και μη εδώδιμων υλικών. Η TDR βασίζεται στη διαβίβαση ενός ηλεκτρομαγνητικού παλμού στο υπο εξέταση υλικό και παρατήρηση της ανάκλασης που μπορεί να επηρεάζεται από τη σύνθεση του δείγματος. 
 

Τα εξαιρετικά παρθένα ελαιόλαδα (EVOOs) και τα ήπια αποσμημένα ελαιόλαδα (sdOOs) είναι διαφέρουν στη χημική σύσταση: λ.χ. έχουν διαφορετική περιεκτικότητα αιθυλεστέρων λιπαρών οξέων (FAEEs). Οι συμβατικές τεχνικές ανάλυσης για τον προσδιορισμό των FAEEs είναι περίπλοκες, χρονοβόρες και προϋποθέτουν αντιδραστήρια. Στα πλαίσια του Oleum, διερευνήθηκε η πιθανότητα καθορισμού της περιεκτικότητας σε FAEEs και της διάκρισης μεταξύ μειγμάτων EVOOs και sdOOs μέσω της τεχνικής TDR. Η οργανολογία που χρησιμοποιήθηκε ήταν σε θέση να παράγει παλμούς και να καταγράφει την ανάκλαση με τη μορφή κυμάτων, με βήματα αυξανόμενου χρόνου της τάξεως μερικών δεκάδων πικοδευτερολέπτων. 
 

Το σχήμα των ανακλώμενων σημάτων αναλύθηκε μέσω πολυμεταβλητής ανάλυσης: χρησιμοποιήθηκε Παλινδρόμηση Μερικών Ελάχιστων Τετραγώνων (PLS) για την κατασκευή προγνωστικών μοντέλων της περιεκτικότητα σε FAAEs και εφαρμόστηκε Διακριτική Ανάλυση PLS για την διάκριση μεταξύ μειγμάτων. Η πρόβλεψη των FAEEs έγινε μέσω παλινδρόμησης, η οποία χαρακτηρίζεται από έναν συντελεστή προσδιορισμού R² ~ 0.81 με Ρίζα Μέσης Τετραγωνικής Απόκλισης (RMSE) της τάξεως δεκάδων mg/kg. Ταξινομήθηκαν ορθά όλα τα δείγματα EVOOs και sdOOs με περιεκτικότητα σε FAEEs μεγαλύτερη ή μικρότερη από το επιλεγμένο όριο (35 mg/kg). Αν και τα αποτελέσματα που προέκυψαν πρέπει να  επιβεβαιωθούν με δοκιμές λαμβάνοντας υπόψη μεταβλητές όπως η θερμότητα, και οι οποίες ενδέχεται να επηρεάσουν την ακρίβεια, η τεχνική αυτή δείχνει να είναι πολλά υποσχόμενη, τουλάχιστον για ένα προκαταρκτικό έλεγχο.
 

Τη δεδομένη στιγμή, οι μετρήσεις TDR, όπως αυτές που διεξήχθησαν για το συγκεκριμένο θέμα, προϋποθέτουν υψηλού κόστους οργανολογία (λ.χ. έναν παλμογράφο) και προσωπικό εξειδικευμένο στις ηλεκτρονικές μετρήσεις και την ανάλυση στατιστικών δεδομένων. Για την διάθεση στην αγορά μίας οργανολογίας για τον προσδιορισμό των FAEEs, καθίσταται αναγκαίος ο συνδυασμός συσκευών και αυτόματων διεργασιών βαθμονόμησης και ανάλυσης εξειδικευμένων για αυτό το σκοπό και όχι ιδιαίτερα υψηλού κόστους. Η κατασκευή και εμπορία μίας τέτοιας συσκευής για τον έλεγχο της συγκεκριμένης νοθείας, η οποία θα κοστίζει περίπου 3000 ευρώ, θα μπορούσε να είναι ελκυστική για τις εταιρείες που κατασκευάζουν οργανολογία ανάλυσης.    

Η Βάση Δεδομένων OLEUM

Tatyana Dimitrova, Alain Maquet, Viet Mai Hoang, Arantza Respaldiza, Alexander Kerner
 

Μία απογραφή των υφιστάμενων βάσεων δεδομένων σχετικά με τις ελιές και τα ελαιόλαδα, ανέδειξε την σπανιότητα αυτών των συστημάτων (λ.χ. το σύστημα ISAMM για τους ελέγχους συμμόρφωσης των ελαιολάδων που διαχειρίζεται η Ευρωπαϊκή Επιτροπή), τα οποία αξιοποιούνται για τον έλεγχο της αυθεντικότητας αυτού του προϊόντος τροφίμου. Συμβούλια των ενδιαφερόμενων μελών, συμπεριλαμβανομένων των εθνικών φορέων ελέγχου, επιβεβαίωσαν την έλλειψη τέτοιων βάσεων δεδομένων,  ενισχύοντας το ενδιαφέρον τους για ένα κοινό σύστημα, το οποίο θα μοιράζεται μεταξύ των κρατών μελών και θα βασίζεται σε εναρμονισμένες αναλυτικές μεθόδους.
 

Κατά τη διάρκεια του έργου, κατασκευάστηκε η Βάση Δεδομένων Oleum, ως μία καινοτόμα πλατφόρμα διαδικτυακής πρόσβασης για την αποθήκευση των εγγράφων και των επικυρωμένων αναλυτικών δεδομένων που παράγονταν από την κοινοπραξία OLEUM. Το σύστημα αυτό αναπτύχθηκε μόνο με την χρήση μοντέρνων και ανοιχτής πηγής τεχνολογιών και παρέχει μεγάλο βαθμό ευελιξίας. Η Βάση Δεδομένων OLEUM θα μπορούσε να θεωρηθεί πως αποτελείται από τρεις βασικές ενότητες – το Αποθετήριο, τη Βάση Δεδομένων και το Εργαλείο αναζήτησης με έναν προηγμένο ρόλο και ελέγχους πρόσβασης.  
 

Το αποθετήριο προορίζεται ειδικά για την αποθήκευση εγγράφων (σε οποιαδήποτε μορφή, όπως pdf, doc, xls, etc.) με μεταδεδομένα που περιγράφουν κάθε έγγραφο όπως ο τίτλος του εγγράφου, συγγραφέας (-είς), ημερομηνία δημιουργίας, ημερομηνία μεταφόρτωσης στο αποθετήριο, σύντομη περιγραφή, σκοπός, κατηγορία, κατάσταση και πολιτική πρόσβασης. Τα μεταδεδομένα χρησιμοποιούνται στην επιλογή αναζήτησης του αποθετηρίου. Ο χρήστης που μεταφορτώνει το έγγραφο στο αποθετήριο, αποφασίζει σχετικά με την πολιτική πρόσβασης που εφαρμόζεται στο έγγραφο. Επί του παρόντος, τα έγγραφα δύναται να αποθηκευτούν ως αρχείο υπολογισμού, πρότυπο αρχείο αναφοράς, τυποποιημένη διαδικασία λειτουργίας (SOP), προδιαγραφή δείγματος αναφοράς και αναφορά επικύρωσης. Αυτή η ενότητα παρέχει έλεγχο έκδοσης, έτσι ώστε κάθε ενημερωμένο έγγραφο να μπορεί να εντοπιστεί όταν παραπέμπεται σε ένα πείραμα. 
 

Η βάση δεδομένων είναι διαρθρωμένη ειδικά για τη διαχείριση και τον εντοπισμό πειραμάτων. Περιληπτικά, ένας χρήστης κατασκευάζει ένα πείραμα επιλέγοντας συμμετέχοντες, ποιες τεχνικές θα χρησιμοποιηθούν σε ποια δείγματα, τις μετρήσεις που συνδέονται με τις επιλεγμένες τεχνικές και δημιουργεί έτσι το υπόδειγμα αναφοράς, συμπεριλαμβανομένων των μεταδεδομένων αυτών των οντοτήτων και τις μετρήσεις που πρέπει να αναφερθούν από τους συμμετέχοντες. Το σύστημα είναι αρκετά ευέλικτο, και επιτρέπει στους χρήστες να τροποποιούν, να προσθέτουν, να ορίζουν υποχρεωτικές και προαιρετικές περιγραφές για οποιεσδήποτε υπάρχουσες ή νέες οντότητες. Η άλλη πλευρά του νομίσματος για αυτήν την ευελιξία, είναι ο αυστηρός έλεγχος των τροποποιήσεων στα μεταδεδομένα για να αποφευχθεί τυχόν πλήθος παραλλαγών στα μεταδεδομένα αυτά. Αυτή η διάρθρωση έχει ως στόχο το να επιτρέπει σε κάθε χρήστη που δεν συμμετέχει σε κάποιο πείραμα να κατανοήσει χάρις σε όλα τα μεταδεδομένα όλες τις λεπτομέρειες των στόχων, των οδηγιών και των αποτελεσμάτων του πειράματος (ή των πειραμάτων) που τον ενδιαφέρουν. Για παράδειγμα, τα μεταδεδομένα ενός δείγματος περιγράφουν είτε ένα δείγμα αναφοράς (οι πληροφορίες καταγράφονται από το χωράφι έως το εμφιαλωμένο ελαιόλαδο), είτε ένα έμπιστο δείγμα (είναι ανιχνεύσιμες πάρα πολλές πληροφορίες), είτε ένα πειραματικό δείγμα (διαθέσιμες πληροφορίες σχετικά με ένα προϊόν) συμπεριλαμβανομένων των υποχρεωτικών / προαιρετικών δεδομένων που αναφέρονται στους σχετικούς κανονισμούς της Ευρωπαϊκής Επιτροπής.  Αξίζει να αναφερθεί πως δύναται η καταχώρηση και άλλων βρώσιμων ελαίων πέραν του ελαιόλαδου. Δυνητικά, με τα κατάλληλα μεταδεδομένα, είναι δυνατή η διαχείριση κάθε μεθόδου ανάλυσης, συμπεριλαμβανομένων των μεθόδων που προτείνονται από το έργο OLEUM, καθώς επίσης και αυτών που χρησιμοποιούνται από τα κράτη μέλη για τον έλεγχο συμμόρφωσης των ελαιολάδων. 
 

Η ενότητα της αναζήτησης επιτρέπει στον χρήστη να αναζητήσει κάθε λέξη κλειδί σε ολόκληρη τη Βάση Δεδομένων Oleum, σε κάθε κατηγορία δεδομένων διαφορετικής οντότητας – έγγραφα, δείγματα, σετ δειγμάτων, πειράματα, αποτελέσματα και τεχνικές. Πρόκειται για ισχυρό εργαλείο, το οποίο επιτρέπει στον χρήστη να εξερευνήσει τα διαθέσιμα δεδομένα στην Βάση Δεδομένων. Τα αποτελέσματα της αναζήτησης εμφανίζονται σε έναν ευέλικτο πίνακα, ο οποίος χρησιμοποιείται για την οπτικοποίηση, επιτρέποντας την απεικόνιση των επιλεγμένων πεδίων, την εφαρμογή διαφορετικών φίλτρων, την αλλαγή μεγέθους των στηλών, την ταξινόμηση κάθε πεδίου κ.λπ. Το περιεχόμενο κάθε τέτοιου πίνακα μπορεί να εξαχθεί ως απλό αρχείο .csv και να αναλυθεί τοπικά στον υπολογιστή από το χρήστη. 
 

Βραχυπρόθεσμα, η Βάση Δεδομένων θα ανοίξει για το κοινό, όμως θα χρειάζεται η εγγραφή του χρήστη για την τροφοδότηση και εκμετάλλευση της βάσης δεδομένων, έτσι ώστε να καταδειχθεί η διαγνωστική ικανότητα των επιλεγμένων αναλυτικών μεθόδων/μετρήσεων στην ανίχνευση των νοθευμένων ελαιολάδων. Μεσοπρόθεσμα, ανάλογα με το συμφέρον των εθνικών φορέων ελέγχου, η πρόσβαση ενδέχεται να περιοριστεί σε αυτούς για λόγους εμπιστευτικότητας. 

Ταχεία μέθοδος φασματοσκοπίας φθορισμού

Μια μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό βιοενεργών λιπόφιλων φαινολικών ενώσεων (τοκοφερόλες ή βιταμίνη Ε) 

Ο ελαιόκαρπος περιέχει μία ποσότητα τοκοφερολών (~90% α-τοκοφερόλη), δηλαδή λιπόφιλων φαινολικών ενώσεων, οι οποίες έχουν αντιοξειδωτική και βιταμινική δράση.
 

Ωστόσο, καθώς οι ενώσεις είναι ευοξείδωτες, η περιεκτικότητα μειώνεται κατά την αποθήκευση του παρθένου ελαιολάδου (ανάλογα με τις επικρατούσες συνθήκες και την φυσική σύνθεση του ελαίου). 
 

H φθορισμομετρική εξέταση του παρθένου ελαιολάδου ώς έχει, εκμεταλλεύεται την παρουσία φυσικών φθοριζουσών συστατικών (δηλαδή της χλωροφύλλης και των παραγώγων της) συμπεριλαμβανομένων των τοκοφερολών.  
 

Η φθορισμομετρική εξέταση των δειγμάτων παρθένου ελαιολάδου πραγματοποιήθηκε μέσω ενός συστήματος με δυνατότητα ανάγνωσης σε μαύρο πλακίδιο με 96 πηγαδάκια. Oι μετρήσεις (λ_{διέγερσης} 302nm, λ_{εκπομπής} 328nm) πραγματοποιήθηκαν μέσω απευθείας μεταφοράς μίας μικρής ποσότητας δείγματος paru;enoy ελαιολάδου (250 µl) που δεν έχει υποστεί πρόσθετη κατεργασία (όπως διάλυση και εκχύλιση, βλ. Σχήμα 1).
 

Τα αποτελέσματα των αναλύσεων φθορισμού των δειγμάτων παρθένου ελαιολάδου με τη χρήση αυτού του συστήματος, βρέθηκε πως έχουν υψηλή συσχέτιση με τον ποσοτικό προσδιορισμό με HPLC της περιεκτικότητας σε α-τοκοφερόλη (βλ. Σχήμα 2). Η μέθοδος αυτή επικυρώθηκε επιτυχώς ενδοεργαστηριακά (δηλαδή όσον αφορά τις παραμέτρους της πιστότητας, ακρίβειας, LOD, LOQ και ανθεκτικότητας).
 

Η προσέγγιση αυτή μπορεί να επιτρέψει τον γρήγορο  έλεγχο μεγάλου πλήθους δειγμάτων ώς προς το ολικό περιεχόμενο σε τοκοφερόλες με μηδενική προετοιμασία των δειγμάτων. 

Σχήμα 1: διάγραμμα ανάλυσης ροής - 250 µl παρθένου ελαιόλαδου μεταφέρονται σε μαύρο πλακίδιο με 96 πηγαδάκια και ακολουθεί καταγραφή του φάσματος φθορισμού.

Σχήμα 2: Συσχέτιση μεταξύ των τιμών συγκέντρωσης α-τοκοφερόλης όπως εκτιμήθηκε φθορισμομετρικά και υγροχρωματογραφικώς HPLC-FLD (μέθοδος αναφοράς).

Φορητό σύστημα που λειτουργεί με μπαταρίες για τον προσδιορισμό της ελεύθερης οξύτητας στο παρθένο ελαιόλαδο

Η ποιότητα του παρθένου ελαιόλαδου επηρεάζεται από διαφορετικούς παράγοντες, όπως η τεχνική παραλαβής και το στάδιο ωρίμανσης του καρπού, καθώς επίσης από τις συνθήκες αποθήκευσης (φως και θερμοκρασία). Για τον προσδιορισμό της ποιότητας του ελαιόλαδού εκτιμάται ένας αριθμός παραμέτρων (λ.χ. η ελεύθερη οξύτητα και η τιμή του αριθμού υπεροξειδίων), καθώς και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Η ελεύθερη οξύτητα είναι η πρώτη και σημαντικότερη παράμετρος για την ποιότητα του παρθένου ελαιόλαδού και η επίσημη μέθοδος για τον προσδιορισμό της είναι χημική (περιλαμβάνει τιτλοδότηση) και πρέπει να πραγματοποιείται σε εργαστήριο από εξειδικευμένο προσωπικό.
 

Το έργο αυτό έχει ως στόχο την ανάπτυξη μίας νέας τεχνικής για τον προσδιορισμό της ελεύθερης οξύτητας του παρθένου ελαιόλαδού, η οποία μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα ως ένα φορητό ηλεκτρονικό σύστημα για επιτόπου γρήγορες και ακριβείς μετρήσεις από χειριστές χωρίς εξειδικευμένη εκπαίδευση. Αυτό επιτρέπει ακόμα και στις μικρότερες μονάδες παραγωγής και τυποποίησης (ελαιοτριβεία και συσκευαστικά κέντρα), τα οποία δεν δύνανται οικονομικά να έχουν ένα εσωτερικό εργαστήριο για αναλύσεις, να πραγματοποιήσουν επιτόπου μετρήσεις ελεύθερης οξύτητας, χωρίς το κόστος και τις χρονικές καθυστερήσεις που προκύπτουν από την αποστολή των δειγμάτων σε εξωτερικά εργαστήρια.
 

H τεχνική βασίζεται στη Φασματοσκοπία Ηλεκτροχημικής Εμπέδησης (EIS), τεχνική κατά την οποία εφαρμόζεται ημιτονοειδής τάση στο υπό δοκιμή δείγμα και εξετάζεται η εμπέδηση (σύνθετη αντίσταση) σε ένα εύρος συχνοτήτων. Στην περίπτωση αυτή, το υπό δοκιμή δείγμα είναι το εναιώρημα μεταξύ ενός υδρο-αλκοολούχου διαλύματος (60% αιθανόλη, 40% αποταγμένο νερό) και του δείγματος παρθένου ελαιόλαδού. Πραγματοποιήθηκαν προκαταρτικές δοκιμές με τη χρήση εμπορικής συσκευής μέτρησης της εμπέδησης (Agilent E4980A) σε εύρος συχνοτήτων 20 Hz – 2 MHz. Τα αποτελέσματα έχουν δείξει πως υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της ελεύθερης οξύτητας του ελαιόλαδου και της ηλεκτρικής αγωγιμότητας που μετράται σε χαμηλές συχνότητες (< 10 kHz).
 

Έχει σχεδιαστεί και κατασκευαστεί ένα φορητό σύστημα για επιτόπου μετρήσεις της ελεύθερης οξύτητας του παρθένου ελαιόλαδου. Το σύστημα έχει διαστάσεις 11 x 15 x 5 εκ. και τροφοδοτείται με ρεύμα μέσω θύρας USB ή μπαταριών (3 αλκαλικές μπαταρίες AAA 1.5 V). Ο ηλεκτρονικός πίνακας, ο οποίος βασίζεται στον μικροελεγκτή STM32L152RCT6A της ST Microelectronics, έχει μία ενσωματωμένη οθόνη LCD για την προβολή των αποτελεσμάτων της μέτρησης, τέσσερα κουμπιά με τα οποία μπορεί να αλληλοεπιδράσει ο χρήστης και όλα τα ηλεκτρονικά εξαρτήματα για τις ηλεκτρονικές μετρήσεις (ηλεκτρονικές μετρήσεις της εμπέδησης στα 200 Hz). Η εμπέδηση του δείγματος (15 mL υδρο-αλκοολούχου διαλύματος και 1 mL ελαιολάδου) γίνεται σε ένα φιαλίδιο Falcon των 50 mL, το οποίο έχει τροποποιηθεί για να φέρει και δύο ηλεκτρόδια από ανοξείδωτο χάλυβα (6 χιλ. διάμετρος, με απόσταση 12 χιλιοστών) για τις ηλεκτρικές μετρήσεις. Το σύστημα έχει βαθμονομηθεί και η καμπύλη βαθμονόμησης αποθηκεύεται στη μνήμη του μικροελεγκτή. Το σύστημα μπορεί να πραγματοποιήσει μετρήσεις ελεύθερης οξύτητας σε περίπου 30 δευτερόλεπτα.
 

Μετά την βαθμονόμηση, η μεθοδολογία επικυρώθηκε ενδοεργαστηριακά μέσω της πραγματοποίησης μετρήσεων σε ένα σετ 30 δειγμάτων παρθένου ελαιολάδου διαφορετικής προέλευσης, με τιμές ελεύθερης οξύτητας μεταξύ 0.18 και 4.5 (Grossi, M.; Palagano, R.; Bendini, A.; Riccò, B.; Servili, M.; García-González, D. L.; Toschi, T. G.; Design and in-house validation of a portable system for the determination of free acidity in virgin olive oil. Food Control, 2019, 104, 208-216). Η ακρίβεια του συστήματος αξιολογήθηκε μέσω της σύγκρισης των αποτελεσμάτων από την εφαρμογή του με τα αποτελέσματα της επίσημης μεθόδου για τα ίδια δείγματα. Βρέθηκε μία θετική συσχέτιση με την επίσημη μέθοδο (R_adj = 0.97) και ελήφθησαν ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον αφορά το όριο ανίχνευσης (LOD), το όριο ποσοτικού προσδιορισμού (LOQ), την πιστότητα και την ακρίβεια. 

Διεργαστηριακές μελέτες

Paul Brereton (Βασιλικό Πανεπιστήμιο του Μπέλφαστ-Queen’s University Belfast)
 

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων μηνών των δραστηριοτήτων του OLEUM, όλοι οι συνεργάτες του έργου ήταν απασχολημένοι αναλύοντας δεδομένα – πολλά δεδομένα. Αυτό συνέβη διότι ολοκληρώνουμε μία από τις μεγαλύτερες διεργαστηριακές μελέτες σε παγκόσμιο επίπεδο. Στην ουσία, πρόκειται για μια σειρά μελετών, οι οποίες περιλαμβάνουν 8 διαφορετικές αναλυτικές μεθόδους με περίπου 15 εργαστήρια για κάθε μέθοδο και που αναλύουν από 10 δείγματα δοκιμής, πρόκειται δηλαδή για πάνω από 1000 τμήματα δεδομένων. Επιπλέον, κάποιες μέθοδοι έχουν δύο αναλυτές και δύο από τις μεθόδους έχουν 18, πράγμα που σημαίνει πως υπάρχουν πάνω από 5000 αποτελέσματα προς ανάλυση! 
 

Οι μέθοδοι που μελετώνται είναι οι εξής:

     1. Ανάλυση πολυφαινολών (πολικών φαινολών) που χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση του ισχυρισμού υγείας στο ελαιόλαδο 

     2. Ανάλυση ελεύθερων και εστεροποιημένων στερολών που έχει ως στόχο τα παράνομα μείγματα ελαιολάδου 

     3. Βελτιωμένη μεθοδολογία για τους αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων που έχει ως στόχο την παράνομη επεξεργασία ή το χαμηλότερης ποιότητας ελαιόλαδο 

     4. Μία ομάδα μεθόδων που εξετάζει την οργανοληπτική ανάλυση και την ανάλυση πτητικών ενώσεων 

          a. Ανάλυση των επιλεγμένων πτητικών ενώσεων στο ελαιόλαδο χρησιμοποιώντας αέρια χρωματογραφία 

               i. GC-MS

               ii. GC-FID 

          b. Ανάλυση του πτητικού αποτυπώματος του παρθένου ελαιολάδου με τη χρήση  SPME-GC-MS και χημειομετρίας ως μέθοδος ελέγχου για την υποστήριξη των πάνελ αξιολόγησης  

          c. Οργανοληπτική ανάλυση των παρθένων ελαιολάδων με τη χρήση δύο Δειγμάτων Αναφοράς. 

Οι παραπάνω μέθοδοι κυμαίνονται από την ελαφρά βελτίωση των υφιστάμενων μεθόδων, λ.χ. οι μέθοδοι 2 και 3, έως τις νέες, προηγμένες διαδικασίες πολλών ενώσεων στόχων/ταυτοποίησης, με στόχο να λειτουργήσουν συμπληρωματικά στο επίσημο πάνελ αξιολόγησης (οργανοληπτική ανάλυση).  

Κατόπιν της προ-δοκιμαστικής μελέτης που πραγματοποιήθηκε κατά το πρώτο εξάμηνο του 2020, το μεγαλύτερο μέρος της κυρίως μελέτης, η «Τελική Δοκιμή Αξιολόγησης» πραγματοποιήθηκε το Φθινόπωρο του 2020. Για κάθε μία από τις παραπάνω μεθόδους, στάλθηκε μία Τυποποιημένη Διαδικασία Λειτουργίας και ένα σετ δειγμάτων (συνήθως 10 δείγματα και ένα δοκιμαστικό δείγμα με μία γνωστή τιμή) στο κάθε εργαστήριο που συμμετείχε στην έρευνα, για να τα αναλύσουν μόνο μία φορά. Χωρίς να το γνωρίζουν οι συμμετέχοντες, τα δείγματα αποτελούνται στην πραγματικότητα από 5 σετ διπλότυπων δειγμάτων που μας επιτρέπουν να υπολογίζουμε την ακρίβεια εντός του εργαστηρίου και μεταξύ των εργαστηρίων. Τα στατιστικά στοιχεία που προέκυψαν επεξεργάστηκαν σύμφωνα με τα διεθνώς αναγνωρισμένα πρότυπα και οι μέθοδοι που μελετήθηκαν μπορούν να αξιολογηθούν έπειτα ως προς την καταλληλόλητά τους ως επίσημες μέθοδοι.    

Τα επίσημα αποτελέσματα θα είναι διαθέσιμα σύντομα, μόλις κοινοποιήσουμε τα αποτελέσματα με τους συμμετέχοντες και ολοκληρώσουμε επίσημα τη μελέτη. Έπειτα, κάποιες από τις διαδικασίες θα προταθούν ως επίσημες μέθοδοι. 

Με την ευκαιρία αυτή, θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τα εργαστήρια που έλαβαν μέρος σε αυτήν τη γιγάντια δράση και την έφεραν εις πέρας κάτω από τις εξαιρετικά δύσκολες συνθήκες της πανδημίας Covid-19.

OLEUM: η εξέλιξη της ποιότητας και του ελέγχου γνησιότητας

Από τη βιωσιμότητα στα μεγάλα δεδομένα για τη συμμόρφωση
 

Από την Tullia Gallina Toschi
 

Το έργο OLEUM ολοκληρώθηκε με ένα τελικό δημόσιο συνέδριο που πραγματοποιήθηκε στις 17 και 18 Φεβρουαρίου, οι μαγνητοσκοπήσεις του οποίου είναι διαθέσιμες στην ιστοσελίδα του έργου. Οι στόχοι του έργου ήταν ρεαλιστικοί. Το OLEUM δεν ήθελε απλώς να διερευνήσει διεξοδικά τους πιθανούς δείκτες γνησιότητας των ελαιόλαδων ανεξαρτήτως του κόστους και της πραγματικής διαθεσιμότητας οργανολογίας στα εργαστήρια ελέγχου ποιότητας. Το  OLEUM επιθυμούσε να εντοπίσει νέες μεθόδους εφαρμόσιμες στις υπάρχουσες οδηγίες ή να ελαττώσει τον χρόνο, τους διαλύτες και τα αναλώσιμα από τις μεθόδους που αναγνωρίζονται ήδη νομικά. Οι λέξεις κλειδιά ήταν «ανανέωση» ή «αναθεώρηση». Σήμερα είναι εμφανής η σημασία της σύνδεσης μεταξύ του έργου και των θεμελιωδών στοιχείων βιωσιμότητας. Η ερευνητική πρόταση του OLEUM, η οποία στάλθηκε στην Ευρωπαϊκή Επιτροπή στις 26 Ιουνίου 2014, προέβλεψε, για παράδειγμα, κάποιες επιδιώξεις του στόχου 12 της διάταξης 2030, η οποία υιοθετήθηκε τα Ηνωμένα Έθνη τον Σεπτέμβριο του 2015, όπως η ανάγκη ελάττωσης εκπομπών και η μη ανακύκλωση ή σπατάλη χημικών (στόχος 12.4). Από την άποψη αυτή, η προσέγγιση του OLEUM μπορεί να επεκταθεί σε πολλά άλλα τρόφιμα. 
 

H έτερη θεμελιώδης πτυχή του έργου, ήταν ο συνδυασμός της πρόληψης και του ελέγχου. Όλα τα ενδιαφερόμενα μέρη για την ποιότητα ενός τόσο σημαντικού τροφίμου όπως το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο (EVOO) βρέθηκαν στο ίδιο τραπέζι: μικροί ή μεσαίοι πρωτογενείς παραγωγοί οι οποίοι επιθυμούν δίκαια αμειβόμενο ελαιόλαδο· μεγάλοι παραγωγοί ή εμφιαλωτές, οι οποίοι χρειάζονται ένα μεγαλύτερο περιθώριο και οι οποίοι πρέπει κατ’ ανάγκη να διαθέτουν διαφορετικές ποσότητες και τιμές στην αγορά, αλλά και οι οποίοι δεν επιθυμούν πλέον να βρίσκονται στη θέση μη συμμόρφωσης ή κάτω από τη νόμιμη ποιότητα· και δημόσια εργαστήρια ελέγχου, τα οποία πρέπει και επιθυμούν να πραγματοποιούν τους ελέγχους με υψηλά διαγνωστικές, αξιόπιστες, ταχείες, αποτελεσματικές και εναρμονισμένες μεθόδους σε όλους τους τομείς. Τελευταίος αλλά εξίσου σημαντικός, ο καταναλωτής, που οφείλει να είναι ενημερωμένος σχετικά με ένα προϊόν που χρησιμοποιείται ευρέως αλλά για το οποίο λίγα είναι γνωστά στην ουσία, και που θέλει εγγυήσεις σχετικά με την ποιότητα. Επομένως, το OLEUM κινήθηκε προς δύο κατευθύνσεις: την ανάπτυξη ταχέων μεθόδων ελέγχου, χρήσιμων για την πρόληψη και τον έλεγχο της ποιότητας στις εταιρείες, αλλά και την ανάπτυξη παράλληλα ευαίσθητων και συγκεκριμένων μεθόδων οι οποίες θα προταθούν στις επιτροπές τυποποίησης προς υιοθέτηση στους δημόσιους ελέγχους ποιότητας. 
 

Ένα από τα προβλήματα ήταν η οργανοληπτική ποιότητα. Αυτή αντιπροσωπεύει έναν από τους τρεις θεμέλιους πυλώνες της ποιότητας του EVOO, μαζί τα αυστηρά στοιχεία της «φρεσκάδας» (η οποία μπορεί να οριστεί ως η ποιότητα του ελαίου τη στιγμή μηδέν) και της ακεραιότητας των αρχικών καρπών. Η τεχνολογική ειδικότητα, καθώς το EVOO είναι ένα προϊόν που έχει υποστεί έκθλιψη, έχει μπει στον φυγοκεντρωτή και έχει φιλτραριστεί (όχι εξευγενιστεί), είναι μία σημαντική ποιότητα, που την μοιράζεται και με το παρθένο ελαιόλαδο (VOO) το οποίο όμως δεν έχει τους ίδιους απαιτητικούς καθοριστικούς παράγοντες με την προηγούμενη ποιότητα. Το EVOO δεν θα μπορούσε να υπάρξει χωρίς άπταιστη οργανοληπτική ποιότητα, ακόμα κι αν αυτό το στοιχείο παραμένει ένα από τα δυσκολότερα ως προς την εκτίμησή του. Είναι γνωστό πως οι περισσότερες μη συμμορφώσεις αφορούν  οργανοληπτικούς παράγοντες. Για τον λόγο αυτό, το OLEUM, εκμεταλλευόμενο όλες τις επιστημονικές δημοσιεύσεις πάνω στο ζήτημα, έχει αναπτύξει και επικυρώσει δύο χρωματογραφικές μεθόδους υψηλής ανάλυσης (SPME-GC/MS και SPME-GC/FID) που προορίζονται για δημόσια εργαστήρια ελέγχου και οι οποίες θα τεθούν στο τραπέζι του Διεθνούς Συμβουλίου Ελαιολάδου (ΔΣΕ), έτσι ώστε να υιοθετηθούν μόλις εδραιωθούν όρια και εύρη για τους σχετικότερους δείκτες. Αυτές οι οργανολογικές μέθοδοι μπορούν να συνδυαστούν με τα πάνελ αξιολόγησης (οργανοληπτική αξιολόγηση) σε περίπτωση αμφίβολων ταξινομήσεων. 
 

Παράλληλα, τα ίδια μέσα πίεσης, ήτοι ο ελάχιστος αριθμός πηκτικών ενώσεων που θεωρούνται υψηλά διαγνωστικοί (15-18 ενώσεις) χρησιμοποιήθηκαν για να προταθούν μέθοδοι ελέγχου ικανοί, για παράδειγμα, να προ-ταξινομήσουν το προϊόν EVOO με βάση την οργανοληπτική ποιότητα. Αυτές οι μέθοδοι θα είναι χρήσιμες ειδικά για τους εμφιαλωτές, κατά τη λήψη της απόφασης σχετικά με την αγορά ή μη μίας παρτίδας ελαίου.
 

Η πρόκληση για το OLEUM, η οποία οδήγησε επίσης στην δημιουργία ενός διεθνούς δικτύου, το οποίο φέρνει κοντά τα ενδιαφερόμενα μέρη, διευρύνει τη γνώση σχετικά με το ελαιόλαδο και το EVOO, προάγει την ανταγωνιστικότητα του προϊόντος και των μεθόδων ελέγχου είναι ένα θετικό μέσο πίεσης.  Αυτά τα μέσα πίεσης, η εναρμονισμένη αυθεντικότητα και η ποιότητα, η κοινή αξιόπιστη επιστημονική κουλτούρα, η οποία απομονώνει μόνο τους απατεώνες, δεν καλλιεργούν τις αλυσίδες της αρνητικής προώθησης και τους μισητές του προϊόντος, αλλά αντίθετα έχουν ως στόχο το να αποδώσουν στην πράξη επιπρόσθετα στοιχεία βεβαιότητας.  
 

Τέλος, δεν εστιάζω στις πολλές κατευθύνσεις στις οποίες προσανατολίστηκε η έρευνα προς αναζήτηση νέων δεικτών και νέων μεθόδων. Μπορώ μόνο να παραπέμψω στην σελίδα του ιστότοπου όπου έχουν συγκεντρωθεί όλα τα άρθρα που δημοσιεύτηκαν έως τώρα και είναι διαθέσιμα σε ανοικτή πρόσβαση, και να τονίσω πως το OLEUM, έχει προσανατολιστεί επίσης στην προοδευτική κατεύθυνση του να προτείνει, για πρώτη φορά, την επικύρωση μίας μη στοχευμένης μεθόδου.
 

Είναι επίσης σημαντικό να αναφερθεί η δύσκολη ερευνητική εργασίας που πραγματοποιήθηκε για την εφαρμογή των δειγμάτων αναφοράς (RMs): τέσσερα έχουν παραχθεί και επικυρώθηκαν. Δύο οργανοληπτικά δείγματα, το ταγγό και το κρασώδες-ξυδάτο και δύο πρότυπα πτητικών ενώσεων, θα χρησιμοποιηθούν ως οργανοληπτικά δείγματα βαθμονόμησης. Σε αυτήν την περίπτωση, ο έλεγχος της ποιότητας του ελαιόλαδου ανοίγει το δρόμο για μια μεγαλύτερη αγορά τροφίμων.
   

Εν κατακλείδι και για να επιχειρήσουμε να δώσουμε μία στρατηγική κατεύθυνση για το μέλλον των ελέγχων της ποιότητας και της αυθεντικότητας του ελαιόλαδου, μία πολλά υποσχόμενη προσέγγιση που θα μπορούσε να ακολουθήσει η ΕΕ περιλαμβάνει: 

1. μία κοινή στρατηγική, για τον συνδυασμό οργανοληπτικών και οργανολογικών δεδομένων (τώρα ένας εύκολος ποσοτικός προσδιορισμός συγκεκριμένων πτητικών είναι οικονομικά προσιτός!), η οποία είναι χρήσιμη σε περιπτώσεις ασυμφωνίας μεταξύ δύο πάνελ·
2. η βελτίωση της επάρκειας και της ευθυγράμμισης των πάνελ μέσω κοινής βαθμονόμησης, η οποία είναι εφικτή στο εγγύς μέλλον, εάν θα γίνουν διαθέσιμα στην αγορά αναπαραγώγιμα δείγματα αναφοράς (RMs)·
3. πραγματικές και ψηφιακές συστάσεις συμμορφώσεις οι οποίες θα εφαρμοστούν και θα αποθηκευτούν (οι ψηφιακές) σταδιακά σε ένα αποθετήριο επικυρωμένων δεδομένων (λ.χ. η βάση δεδομένων OLEUM) για να χρησιμοποιηθούν ως αναφορές αυθεντικότητας·
4. οι πληροφορίες σχετικά με την ποιότητα και την αυθεντικότητα του ελαιόλαδου να τεθούν σε σχέση με τον όγκο και την γεωγραφική τοποθεσία παραγωγής του. Η τομή μεταξύ των επίσημων ελέγχων ποιότητας και της ιχνηλασιμότητας, η οποία είναι τυπική σε ένα σενάριο blockchain, θα μπορούσε να είναι το επόμενο μέτρο ενάντια στην απάτη.   
    

Όλα κινούνται από έναν μοναδικό δείκτη ποιότητας και αυθεντικότητας προς το γενικό όραμα για ένα ελαιόλαδο που θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως «βιομετρικό». Αλλά πρέπει να προχωρήσουμε με σταδιακά αυξανόμενη, απλή και αξιόπιστη προσέγγιση, διυλίζοντας σταδιακά τα περίπλοκα στοιχεία για να δημιουργήσουμε μία νέα αποτελεσματική σύνθεση, αποφεύγοντας τους εντυπωσιασμούς, οι οποίοι έχουν ως αποτέλεσμα αβεβαιότητα και πρόχειρες εκτιμήσεις. Αυτή είναι η δύσκολη πρόκληση που έχει κερδίσει το OLEUM. 

Abschlusskonferenz des OLEUM-Projekts

Am 17. und 18. Februar 2021 hielt das OLEUM-Projekt seine Abschlusskonferenz erfolgreich ab. Insgesamt haben sich über 400 Personen aus verschiedenen Bereichen für das Online-Meeting angemeldet, um die Ergebnisse des Projekts zu ermitteln und die zukünftigen Möglichkeiten zur Sicherung der Qualität und Authentizität von Olivenöl zu erörtern.

Die Veranstaltung war in zwei Tage unterteilt, wobei der erste Tag auf die Ergebnisse und Auswirkungen von OLEUM auf die Zukunft der europäischen Olivenölpolitik abzielte und der zweite Tag sich auf die neu entwickelten Analysewerkzeuge und -methoden konzentrierte, um die Qualität und Authentizität von Olivenöl weiter sicherzustellen.

Prof. Giovanni Molari, Leiter der Abteilung für Agrar- und Lebensmittelwissenschaften an der Universität von Bologna, begrüßte die Teilnehmer, bevor die Projektkoordinatorin Prof. Dr. Tullia Gallina Toschi einen Überblick über die wichtigsten Ergebnisse des OLEUM-Projekts gab und erklärte, welche Chancen sich daraus ergeben sind von großem Interesse und äußerst wertvoll für den Markt. Die Ergebnisse des OLEUM-Projekts werden auch bei der Entwicklung der künftigen EU-Olivenölpolitik berücksichtigt.

"Wir müssen eine prägende Rolle bei Olivenöl und EVOO spielen." - Prof. Dr. Tullia Gallina Toschi

Das internationale und kontinuierlich wachsende OLEUM-Netzwerk sammelt und erweitert das hochwertige Know-how bei der Analyse und Authentifizierung von Olivenölen. Dies führt zu neuen und innovativen Instrumenten und Methoden, um betrügerischen Aktivitäten entgegenzuwirken und die Qualität von Olivenöl zu schützen. Die Ergebnisse dieser Methoden können in der OLEUM-Datenbank gespeichert werden. Dies ist eines der wichtigsten Ergebnisse des Projekts und trägt zur Verbesserung des Informationsaustauschs zwischen verschiedenen Interessengruppen der Olivenölgemeinschaft bei. Aufgrund der vielen falschen Informationen rund um Olivenöl aus verschiedenen Quellen ist es ein wichtiger Teil des Projekts, der Öffentlichkeit zuverlässige und wissenschaftlich fundierte Informationen zu liefern, weshalb der Kommunikationsteil des OLEUM-Projekts von großer Bedeutung ist.

Die jeweiligen Methoden wurden am zweiten Tag der OLEUM-Abschlusskonferenz von ihren Entwicklern vorgestellt und erklärt. Die Teilnehmer erhielten einen Einblick in die technischen Hintergründe und hatten die Möglichkeit, Fragen der Entwickler in einer Q & A-Sitzung zu klären.

Das Feedback am Ende der Konferenz sowie im Chat und über soziale Medien war großartig und das OLEUM-Team möchte sich bei allen Teilnehmern und Referenten dafür bedanken, dass dies möglich ist!

Weitere Informationen zu den wichtigsten Ergebnissen des Projekts, den Aufzeichnungen der Abschlusskonferenz und anderen Ressourcen finden Sie in dem virtuellen Paket, das wir für Sie vorbereitet haben: Klicken Sie hier

Die Aufzeichnung der Abschlusskonferenz finden Sie hier!

Das Netzwerk von OLEUM

Tassos Koidis, Paul Breton und Enrico Valli
 

Seit unserem letzten Bericht wächst das Netzwerk von Oleum stetig, sowohl inhaltlich als auch in Bezug auf seine Mitgliederzahl. Wir haben mittlerweile 120 Mitglieder in unserer OLEUM Basecamp-Plattform (18 % Zuwachs) und 164 Mitglieder (21 % Zuwachs) in OLEUM „Frage des Monats“, unserem LinkedIn-Netzwerk. Wir haben 3 zusätzliche Q&As veröffentlicht (F1: Wahr oder Falsch? Das Erhitzen von Olivenöl führt zur Bildung von Transfettsäuren. F2: Was ist Remolido-Öl? F3: Ist kaltgepresstes EVOO immer besser als normales VOO?). 

Für einige unserer OLEUM-Mitglieder, die die Methodenbewertungsstudien durchführten, war es eine arbeitsreiche Zeit, die kurz vor Weihnachten endeten. Die Mitglieder, die in privaten und öffentlichen Prüflabors arbeiten, wie Jorge von Sovena, fanden es sehr nützlich, dass sie frei auf das Schulungsmaterial der beiden OLEUM-Workshops, die in Spanien (19. Oktober) und Italien (19. Dezember) stattfanden, aus den Ressourcen des OLEUM-Netzwerks zugreifen konnten. Zudem sind in letzter Zeit viele neue Studenten dem Netzwerk beigetreten, wie Gabriela von der Universität Cordoba, Spanien, die schrieb: „Ich hatte Informationen über Olivenöl nötig, um mein Abschlussprojekt vorzubereiten und insbesondere über die Technik der Gaschromatographie- zur Klassifizierung von Olivenöl in die drei Kategorien extra nativ, nativ und lampant. Ich schloss meine Arbeit im Oktober 2020 ab und warte derzeit auf die Bewertung, um in ein PhD-Programm an der gleichen Universität aufgenommen zu werden." Seit der jüngsten Ankündigung der OLEUM-Abschlusskonferenz erhält das Netzwerk neue Aufmerksamkeit mit täglichen Anmeldungen. Wir, die Leute hinter dem OLEUM-Projekt, haben viele Ideen für die Zukunft des OLEUM-Netzwerks, die über das offizielle Ende des Projekts hinausgehen. Hauptsächlich würden wir uns jedoch darüber freuen, Ihre Meinung zu hören. Treten Sie dem Netzwerk bei (über LinkedIn hier). Wenn Sie Interesse daran haben, was in der OLEUM-Abschlusskonferenz über die nächsten Schritte des Netzwerks besprochen wurde, finden Sie die Aufzeichnung der Konferenz hier.

Zwei sensorische Referenzmaterialien

Prof. Alessandra Bendini, Dr. Diego Luis Garcia Gonzalez, Prof. Tullia Gallina Toschi

Bei nativem Olivenöl besteht die sensorische Beurteilung aus einer Standardmethode, deren Anwendung nach den Normen des Internationalen Olivenrates (IOC) und anderen nationalen und internationalen Vorschriften (EU-Verordnungen, Codex Alimentarius) für die Festlegung möglicher Qualitätsstufen (z.B. für die EU: extra nativ, nativ, lampant) und für die Vermarktung des Produktes verbindlich ist.
 

Die Laboratorien, die die Analysemethoden anwenden, müssen ihre Kenntnisse bei der Anwendung der Prüfmethoden nach den von der EU und dem IOC beschriebenen Verfahren mit Versuchen nachweisen, die die Gültigkeit der Ergebnisse sicherstellen: Dieses Beurteilungsverfahren sollte mit Referenzmaterialien (RMs) durchgeführt werden. Die Verwendung von RMs wird in den aktuellen Vorschriften als notwendig für die sensorische Analyse erwähnt (COI/T.28/Doc.Nr.1/Rev.4; COI/T.20/Doc. Nr.14/Rev.5). 
 

Um das Messverfahren zu kalibrieren, den Prüfern bei der Erinnerung an sensorische Reize zu helfen und ihr Urteil mit „zugewiesenen Werten“ zu vergleichen und somit schlussendlich ihre individuellen Fähigkeiten zu verbessern ist die Verwendung von Referenzmaterialien (RMs), wofür definitive numerische Werte mit verschiedenen sensorischen Eigenschaften verknüpft werden können, von absoluter Notwendigkeit. Aus diesen Gründen sollten RMs für die kontinuierliche Überwachung von Panels im Laufe der Zeit sowie für Intra-Panel- und Inter-Panel-Kontrollstudien eingesetzt werden. Darüber hinaus könnten RMs auch sehr nützlich für die Auswahl und das Training von neuen Bewertern sein, die in zahlreichen Kursen angenommen werden, die auf nationaler und internationaler Ebene von verschiedenen Organisationen veranstaltet werden und die auf die spezielle Ausbildung von sensorischen Panelmitgliedern für native Olivenöle ausgerichtet sind. 
 

Für die sensorische Analyse von VOOs stehen derzeit ausschließlich RMs aus natürlichen Matrizen (authentische Olivenöle, die als Referenzproben für sensorische Fehler verwendet werden, die vom IOC zur Verfügung gestellt werden, Proben aus Ringversuchen oder die von mindestens drei anerkannten sensorischen Panels zertifiziert wurden) für die Schulung von sensorischen Panels zur Verfügung; sie sind den realen Proben sehr ähnlich, obwohl sie einige Einschränkungen in ihrer Verwendung im Laufe der Zeit haben (z.B. begrenzte Verfügbarkeit, schwierige Beschaffung, geringe Homogenität von Jahr zu Jahr).
 

RMs, welche die Aromen von säuerlichen und ranzigen Fehlern nachahmen, wurden vom CSIC in spezifischen Verdünnungen formuliert, wofür eine Sammlung synthetischer flüchtiger Verbindungen verwendet wurde, die in einem geschmacksneutralen raffinierten Olivenöl in spezifischen Konzentrationen verdünnt wurden (Aparicio-Ruiz et al., 2020, Foods, 9(12), 1870). Daraufhin koordinierte die UNIBO ihre sensorische Bewertung innerhalb des OLEUM-Konsortiums (sechs Panels waren beteiligt) sowie im Rahmen der gerade abgeschlossenen laborübergreifenden Bewertung (Vorversuchs- und eigentliche Versuchsphase).
 

Die wichtigsten Ergebnisse der Inter-Lab-Bewertung waren:

Die Bewertung des Repräsentationsgrads der Referenzmaterialien (RM1 und RM2) im Hinblick auf die Beurteilung ihrer „Nützlichkeit bei der Nachahmung natürlicher sensorischer Fehler von säuerlich und ranzig" durch die Panelmitglieder: Die erhaltenen Daten haben gezeigt, dass die RMs von einer hohen Anzahl der Endverbraucher als geeignet bewertet wurden.

Die Berechnung der wahrgenommenen Intensitäten der säuerlichen und ranzigen Fehler (RM1 und RM2), da die Definition der Intensität jedes sensorischen RM eine fundamentale Information ist, um seine mögliche zukünftige Verwendung in der Ausbildung von Bewertern zu ermöglichen: die Angleichung zwischen den Panels in Bezug auf die Fehlerintensität in jedem RM wurde erreicht.

Software zur Schätzung des „Mindesthaltbarkeitsdatums“ von EVOOs

Von Maurizio Servili und Tullia Gallina Toschi

Der Grad und die Geschwindigkeit der Qualitätsverschlechterung von EVOO werden stark von der chemischen Zusammensetzung und den Lagerungsbedingungen (Verpackung, Temperatur und Lichteinwirkung) beeinflusst und sind in Bezug auf diese Faktoren nachweislich extrem variabel. Das auf dem Etikett angegebene Mindesthaltbarkeitsdatum (MHD) eines EVOOs (d.h. die Mindestlagerzeit, innerhalb der native Olivenöle ihre chemischen und sensorischen Parameter innerhalb der deklarierten Kategorie beibehalten) liegt in der Entscheidung des Herstellers. Die einzige andere objektive Information über das Alter des Öls, die aufgezeichnet werden kann (wenn 100 % des Inhalts des Behälters aus einer Ernte stammen), ist das Erntejahr (oder Erntemonat).
 

Wie können die Hersteller auf wissenschaftlicher Grundlage ein zuverlässiges MHD für ihr EVOO angeben, wenn sie derzeit keine objektiven Methoden haben, an denen sie sich orientieren können? Die Verfügbarkeit eines Instruments zur Bestimmung des MHD und seine präventive Anwendung könnten die beste Verteidigung gegen den Vertrauensverlust der Verbraucher und das Risiko von Betrugsvorwürfen darstellen. 

Um diese Lücke zu schließen, wurde im Rahmen des Oleum-Projekts eine Software entwickelt und bewertet, die das MHD von bestimmten EVOOs bei gegebenen Lagerbedingungen vorhersagen kann. 

Zur Erreichung des Endgültigen Ziels, wurden Vorhersagemodelle auf der Grundlage einer großen analytischen Datenbank erstellt, die durch Verfolgung der Entwicklung ausgewählter analytischer Parameter in einem Echtzeit-Haltbarkeitsdauer-Experiment an 20 EVOO-Proben erstellt wurde. Diese Proben wurden nach dem D-optimalen Design unter Verwendung des Most Descriptive Compound (MDC)-Algorithmus ausgewählt, um die experimentelle Domäne mit Ölen abzudecken, die durch eine Kombination von niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen ausgewählter Fettsäuren, hydrophiler Phenole und Tocopherole gekennzeichnet werden.

Diese 20 EVOO-Proben wurden vollständig analytisch auf ihre gesetzlichen Qualitätsparameter, das Fettsäureprofil, die Antioxidantien (hydrophile Phenole und Tocopherole), die flüchtige Verbindung, die DAGs und den OSI klassifiziert, in UVA-Glasflaschen abgefüllt und für 12 Monate in Regalen mit Aussetzung an Licht (für 12 h/Tag; 25 °C) und für 24 Monate in der Dunkelheit (25-30-35 °C) gelagert. Die Proben und Analysen wurden monatlich an den Glasflaschen durchgeführt, wenn sie dem Licht ausgesetzt waren und alle zwei Monate, sobald sie in der Dunkelheit gelagert waren.

Die während des Echtzeit-Haltbarkeitsdauer-Experiments analysierten Parameter für die Modellerstellung waren: Säuregehalt, Peroxidwert, K232, K270, ∆K, hydrophile Phenole, α-Tocopherol, flüchtige Verbindungen und Fettsäurezusammensetzung. 
 

Der gesamte Datensatz, der aus den Analyseergebnissen gewonnen wurde, wurde verwendet, um zwei verschiedene Vorhersagemodelle zu erstellen: Eines für die Aussetzung an Licht und eines für die dunklen Bedingungen der Lagerung.
 

Diese Vorhersagemodelle wurden durch einen multivariaten statistischen Ansatz erstellt. Die Koeffizienten zur Berechnung der fehlenden Zeit für das Erreichen der Schwellenwerte ausgewählter Rechts-/Qualitätsparameter, um das MHD zu bestimmen, wurden durch die beiden Modelle hochgerechnet. 
 

Die Prognosefähigkeit wurde durch interne und externe Bewertungen geprüft und hat eine zufriedenstellende Genauigkeit bei der Vorhersage des Datums aufgezeigt, an dem die wichtigsten Qualitäts- und/oder gesetzlichen Parameter überschritten werden (in Bezug auf K270, die Konzentration der hydrophilen Phenole, Schwellenwert der flüchtigen Verbindungen für den ranzigen Fehler).
 

Die Software wurde mit einer benutzerfreundlichen Oberfläche entwickelt, wodurch die Eingaben zur Vorhersage des MHD eines EVOOs die Folgenden sind: Name der Probe, Lagerungsbedingung (hell/dunkel und Temperatur) und eine Auswahl an analytischen Parametern. Das Ergebnis wird durch die Zeit für das Überschreiten des Schwellenwertes (in Monaten) dargestellt. Die Genauigkeit der Vorhersage des MHD ist zufriedenstellend, um ein Instrument für die Bedürfnisse der Hersteller und zur Stärkung des Verbrauchervertrauens bereitzustellen.

Standardisierte Stammlösungen, die bei der Analyse der flüchtigen Verbindungen verwendet werden können

Positive und negative sensorische Eigenschaften in nativen Olivenölen (VOOs) hängen stark von der Zusammensetzung der flüchtigen Verbindungen ab. Bis heute wird die organoleptische Prüfung von VOOs in Bezug auf das Vorhandensein und die Intensität dieser sensorischen Eigenschaften nach einer Methode durchgeführt, die als Panel-Test bekannt ist. Da es bei der Klassifizierung von VOOs durch verschiedene Panels zu Widersprüchen kommen kann, kommt der Bestätigung/Falschinformation durch die qualitative und quantitative Analyse spezifischer flüchtiger organischer Verbindungen (VOCs), die für die Mängel oder die positiven Eigenschaften verantwortlich sind, große Bedeutung zu. In diesem Sinne wurden im Rahmen des OLEUM-Projekts Methoden für die Analyse flüchtiger Verbindungen in VOOs vorgeschlagen, die auf verschiedenen analytischen Techniken zurückgreifen: von den am meist gefestigtsten Techniken SPME-GC-FID und SPME-GC-MS bis hin zum innovativsten HS-GC-IMS, wobei die HS-GC-IMS-Technik eher für ein Screening geeignet ist, das zur Einteilung von VOOs in die jeweilige Qualitätsstufe (extra nativ, nativ und lampant) verwendet werden kann. Zur Unterstützung des Panel-Tests kann eine qualitative und quantitative instrumentelle Analyse der flüchtigen Verbindungen relevant sein, um zusätzlich, sobald die Signale/Markierungen bewertet wurden, Konzentrationsgrenzen der relevanten Verbindungen, die den Fehlgeschmack beschreiben, für die verschiedenen Qualitätsstufen festzulegen. Auf der Grundlage von analytischen Untersuchungen, die im Rahmen des OLEUM-Projekts durchgeführt wurden, wurden 18 flüchtige Verbindungen ausgewählt, mit dem Ziel, einen Satz mit einer Mindestanzahl von hochdiagnostischen Verbindungen zu erhalten, die auf dem Markt leicht erhältlich sind. Diese wurden anschließend in zwei Standardmatrizen (SMA und SMB) gruppiert, die in raffiniertem Olivenöl aufgelöst wurden, um die Anzahl der Analysen für die Erstellung der Kalibrierkurven drastisch zu reduzieren. Die Auswahl der 18 flüchtigen Verbindungen in SMA oder SMB basierte auf: i) ihrem üblichen Vorhandensein in VOOs (hohe oder niedrige Konzentration) und ii) der Notwendigkeit, die möglichen Überlagerungen zwischen den Verbindungen zu begrenzen, die andernfalls die Einbindung der Spitzenwerte erschweren würden, um so den Vergleich der Ergebnisse zwischen den Laboren zu erleichtern.
 

Die gleichen Mischungen können auch als Kalibriermaterial für die Entwicklung von schnellen Screening-Methoden verwendet werden; mindestens 15 der 18 flüchtigen Verbindungen können, wie kürzlich in Foods veröffentlicht, herausgelöst und mit einem HS-GC-IMS nachgewiesen werden. Die Zusammensetzung dieser Matrizen wurde in einigen öffentlichen Veranstaltungen vorgestellt und wird in einem anderen wissenschaftlichen Artikel, der in Food Control veröffentlicht wurde, detailliert beschrieben.

Instrument, das auf der TDR-Technik basiert, das zur Erkennung von Mischungen von EVOOs mit zugeschnittenen weich-desodorierten Olivenölen nützlich ist

Die Time Domain Reflectometry (TDR) ist eine bekannte Technik, die in verschiedenen Bereichen eingesetzt wird: Überprüfung von Unregelmäßigkeiten in elektrischen Leitungen, Bestimmung der Bodenfeuchte, dielektrische Kennzeichnung von Food und Non-Food-Materialien. TDR basiert auf der Reaktion der Materie auf einen elektromagnetischen Schritt, der Zeit braucht, um durchlaufen und reflektiert zu werden, und der seine Form entsprechend der chemisch-physikalischen und strukturellen Zusammensetzung des Materials ändert. Je kleiner die Probe ist, desto schneller ist der elektromagnetische Schritt. 

Extra native Olivenöle (EVOOs) und weich-desodorierte Olivenöle (sdOOs) sind chemisch unterschiedlich: Sie haben beispielsweise einen unterschiedlichen Gehalt an Fettsäureethylestern (FAEEs). Die klassischen Analysetechniken zur Bestimmung von FAEEs sind komplex, zeitaufwendig und erfordern Reagenzien. Im Oleum-Kontext wurde die Möglichkeit der Bestimmung des FAEEs-Gehalts und der Unterscheidung zwischen Mischungen von EVOOs und sdOOs mit TDR untersucht. Das verwendete Instrument war in der Lage, die Wellenform von Stufen mit einer Anstiegszeit in der Größenordnung von einigen zehn Pikosekunden zu erzeugen und zu erfassen, wodurch eine Sonde für einige ml der Probe verwendet werden konnte. 

Die Form der reflektierten Signale wurde mit einer multivariaten Analyse analysiert: Die Partial Least Squares Regression (PLS) wurde verwendet, um Vorhersagemodelle für den FAAEs-Gehalt zu erstellen, und die PLS-Diskriminanzanalyse (PLS-DA) wurde für die Unterscheidung zwischen den Mischungen verwendet. Die FAAEs wurden mit einer Regression vorhergesagt, die sich durch einen Bestimmungskoeffizienten (^R2) von etwa 0,81 und mit einem Root Mean Square Error (RMSE) von zehn mg/kg kennzeichnete. Mischungen von EVOOs und sdOOs mit einem FAEE-Gehalt über oder unter dem gewählten Grenzwert (35 mg/kg) wurden als korrekt klassifiziert. Obwohl die erzielten Ergebnisse durch Bestätigungstests unter Berücksichtigung von Variablen wie beispielsweise Temperatur, die einen Einfluss auf die Genauigkeit haben können, bestätigt werden müssen, scheint die Technik zumindest für ein Screening sehr vielversprechend zu sein. 

Im Moment erfordern TDR-Messungen, wie sie hier durchgeführt wurden, teure, multifunktionale, generische Instrumente (z.B. ein Oszilloskop) und Personal, das in elektronischen Messungen und statistischer Datenanalyse geschult ist; denkt man an eine Marktdiffusion eines Instruments für FAEEs-Erkennungen, wird es sicherlich notwendig sein, Geräte zu kombinieren und Kalibrierungsverfahren und Analysefunktionen in einem speziellen und preisgünstigen Hilfsmittel zu automatisieren. Die Umsetzung und Vermarktung eines solchen Geräts für Screening-Tests, das etwa 3.000 Euro kostet, könnte für Unternehmen, die analytische Instrumente herstellen, interessant sein.

Die OLEUM-Datenbank

Tatyana Dimitrova, Alain Maquet, Viet Mai Hoang, Arantza Respaldiza, Alexander Kerner
 

Eine Bestandsaufnahme der bestehenden Datenbanken für Oliven und Olivenöle hat gezeigt, dass Systeme (z.B. das von der EG verwaltete ISAMM-System für die Konformitätskontrolle von Olivenölen), die die Echtheit dieses Lebensmittels kontrollieren, selten sind. Beratungen von Interessengruppen, einschließlich nationaler Kontrollorgane, bestätigten den Mangel an solchen Datenbanken und verstärkten das Interesse an einem gemeinsamen System, das von den Mitgliedstaaten gemeinsam genutzt werden kann und auf harmonisierten Analysemethoden beruht.
 

Während des Projekts wurde die OLEUM-Datenbank als innovative Online-Zugangsplattform aufgebaut, um die vom OLEUM-Konsortium generierten Dokumente und bewerteten Analysedaten zu speichern. Das System wurde ausschließlich mit modernen und Open-Source-Technologien entwickelt und bietet eine große Flexibilität. Die OLEUM-Datenbank besteht aus drei grundlegenden Modulen: Projektarchiv, Datenbank und Suchmodul mit einem hochentwickelten Rollen- und Zugriffsmanagement.
 

Das Projektarchiv kann zum Speichern von Dokumenten verwendet werden (in beliebigen Formaten wie pdf, doc, xls usw.) mit Metadaten, die jedes einzelne Dokument beschreiben, wie z.B. Titel des Dokuments, Autor(en), Erstellungsdatum, Datum des Hochladens in das Projektarchiv, Kurzbeschreibung, Zweck, Kategorie, Status, Zugriffsrichtlinie. Die Metadaten werden für die Suchoption des Projektarchivs verwendet. Der Benutzer, der die Datei in das Projektarchiv hochlädt, entscheidet, welche Zugriffsrichtlinie für das Dokument gelten soll. Im Moment können Dokumente als Berechnungsdatei, Reporting-Dateivorlage, Standard Operating Procedure (SOP), Spezifikation eines Referenzmaterials und Bewertungsbericht gespeichert werden. Dieses Modul unterstützt die Versionskontrolle, damit jedes aktualisierte Dokument nachverfolgt werden kann, wenn in einem Experiment darauf Bezug genommen wird.
 

Die Datenbank ist so strukturiert, dass Experimente verwaltet und verfolgt werden können. Zusammenfassend kann ein Benutzer ein Experiment erstellen, indem er die Teilnehmer auswählt, welche Techniken sie für welche Proben verwenden müssen, die Messwerte, die mit den ausgewählten Techniken verknüpft sind, und die Reporting-Vorlage erstellen, die die Metadaten dieser Einheiten und die Messwerte enthält, die von den Teilnehmern angegeben werden sollen. Das System ist sehr flexibel und erlaubt es dem Benutzer, für bestehende und neue Einheiten obligatorische und optionale Beschreibungen zu ändern, hinzuzufügen und zu setzen. Die Kehrseite dieser Flexibilität ist eine strenge Kontrolle aller Änderungen der Metadaten, um eine Vielzahl von Metadatenvarianten zu vermeiden. Diese Struktur bezweckt, dass jeder Benutzer, der nicht an einem Experiment beteiligt ist, dank aller Metadaten alle Details über die Ziele, Bedingungen und Ergebnisse des/der vorliegenden Experiments/Experimente verstehen kann. Die Metadaten einer Probe beschreiben beispielsweise entweder eine Referenzprobe (Informationen werden vom Feld bis zum abgefüllten Öl zurückverfolgt) oder eine vertrauenswürdige Probe (eine große Menge an Informationen ist rückverfolgbar) oder eine experimentelle Probe (verfügbare Informationen über ein Produkt) einschließlich der obligatorischen/freiwilligen Daten, die in den betreffenden EG-Verordnungen erwähnt werden. Es ist von Bedeutung um zu erwähnen, dass neben dem Olivenöl auch andere Speiseöle registriert werden können. Eventuell können alle Analysemethoden mit entsprechenden Metadaten bearbeitet werden, einschließlich der vom OLEUM-Projekt vorgeschlagenen Methoden, aber auch andere, die von den Mitgliedsstaaten zur Konformitätsüberprüfung von Olivenölen verwendet werden.
 

Das Suchmodul gibt dem Benutzer die Möglichkeit, jedes beliebige Stichwort in der gesamten OLEUM-Datenbank zu suchen, und zwar in jeder der verschiedenen Datenkategorien - Dokumente, Proben, Probensätze, Experimente, Ergebnisse und Techniken. Dieses Modul ist sehr leistungsfähig und es erlaubt dem Benutzer, die verfügbaren Daten in der Datenbank zu erkunden. Die Suchergebnisse werden in einer flexiblen Tabelle dargestellt, die für die Darstellung verwendet wird und es erlaubt, die Felder auszuwählen, die dargestellt werden sollen, verschiedene Filter anzuwenden, die Größe der Spalten zu verändern, jedes Feld zu sortieren usw. Der Inhalt jeder dieser Tabelle kann als einfache csv-Datei exportiert und vom Benutzer lokal auf dem PC analysiert werden.
 

Kurzfristig wird die Datenbank für die Öffentlichkeit zugänglich gemacht Es wird eine Registrierung benötigt, um auf die Datenbank zuzugreifen und um die diagnostische Fähigkeit ausgewählter Analysemethoden/Messgrößen zum Nachweis von verfälschten Olivenölen zu demonstrieren. Mittelfristig, je nach Interesse der nationalen Kontrollorgane, könnte der Zugang aus Gründen der Geheimhaltung auf diese Kontrollorgane beschränkt bleiben.

Schnelle fluoreszenz-spektroskopische Methode

Eine Methode zur Erfassung der Menge an bioaktiven lipophilen phenolischen Verbindungen (Tocopherole oder Vitamin E)
 

Frische Olivenöle enthalten eine variable Menge an Tocopherolen, lipophile phenolische Moleküle, die sich durch antioxidative und Vitamin-Aktivitäten auszeichnen (insbesondere Alpha-Tocopherol kann die Rolle des Vitamin E spielen).
 

Da diese Verbindungen jedoch oxidationsempfindlich sind, sinkt ihr Gehalt während der Lagerung des Öls (abhängig von den Bedingungen und von der natürlichen Zusammensetzung der Probe des Olivenöls).
 

Die Fluoreszenzanalyse von Olivenölen nutzt das Vorhandensein natürlicher fluoreszierender Verbindungen (z.B. Chlorophylle und Derivate) einschließlich der Tocopherole.
 

Die Fluoreszenzspektroskopie der Olivenölproben wurde mit einem 96-Wells Black Plate Reader durchgeführt. 
 

Für die Messungen (Anregung bei 302 nm und Emission bei 328 nm) wurde direkt eine kleine Menge der Olivenölprobe (250 µl) ohne zusätzliche Behandlungen (wie Verdünnung und Extraktion, siehe Abbildung 1) übertragen.
 

Die Ergebnisse der Fluoreszenzanalysen der Olivenölproben, die mit dieser Methode durchgeführt wurden, haben einen hohen Zusammenhang mit der HPLC-Quantifizierung des Gehalts an Alpha-Tocopherol (siehe Abbildung 2) aufgezeigt. Diese Methode wurde erfolgreich intern bewertet (z.B. in Bezug auf Parameter wie Präzision, Genauigkeit, LOD, LOQ, Robustheit).
 

Dieser Ansatz ermöglicht ein schnelles Hochdurchsatz-Screening der Gesamtmenge an Tocopherolen in Olivenölproben mit fast keiner Vorbereitung der Proben.

Abbildung 1: Analyseflussdiagramm - 250 µl natives Olivenöl wird in 96-Well-Platten übertragen und einer fluoreszenzspektroskopischen Analyse unterzogen.
 

Abbildung 2: Zusammenhang zwischen Alpha-Tocopherol-Konzentrationen, ermittelt unter Verwendung der fluoreszenzspektroskopischen Analyse und der HPLC-FLD-Referenzmethode.

Tragbares batteriebetriebenes System zur Bestimmung des freien Säuregehalts in nativem Olivenöl

Die Qualität des Olivenöls wird durch verschiedene Faktoren wie das Extraktionsverfahren, das Reifestadium der Früchte sowie die Lagerbedingungen (Licht und Temperatur) beeinflusst. Auch eine Reihe von Parametern (z.B. freier Säuregehalt, Peroxidwert) sowie sensorische Eigenschaften werden bewertet, um die Qualität des Olivenöls zu bestimmen. Der freie Säuregehalt ist der erste und wichtigste Parameter für die Bestimmung der Qualität des Öls. Die offizielle Methode dafür ist eine chemische Titration, die in einem Labor von geschultem Personal durchgeführt werden muss.
 

Dieses Projekt richtet sich auf die Entwicklung einer neuartigen Technik zur Bestimmung des freien Säuregehalts von Olivenöl, die als tragbares elektronisches System für schnelle und genaue Messungen vor Ort durch Bediener ohne spezielle Ausbildung umgesetzt werden kann. Dadurch können auch kleinere Produktionszentren (Ölmühlen und Verpackungszentren), die sich kein eigenes Labor leisten können, Messungen des freien Säuregehalts vor Ort durchführen, ohne die Kosten und Zeitverzögerungen, die mit dem Versand der Proben an ein externes Labor verbunden wären.
 

Das Arbeitsprinzip der Messung stützt sich auf der Elektrischen Impedanzspektroskopie (EIS), eine Technik, bei der eine Sinusspannung an die Probe angelegt wird, die getestet werden soll, und deren elektrische Eigenschaften in einem Frequenzbereich gemessen werden. In diesem Fall ist die Probe, die getestet werden soll, die Emulsion zwischen einer hydroalkoholischen Lösung (Ethanol 60 %, destilliertes Wasser 40 %) und der Olivenölprobe. Die Voruntersuchungen wurden mit einem kommerziellen Impedanz-Analysator (Agilent E4980A) im Frequenzbereich von 20 Hz - 2 MHz durchgeführt. Die Ergebnisse haben aufgezeigt, dass ein Zusammenhang zwischen der ölfreien Säure und der elektrischen Leitfähigkeit der Emulsion, gemessen bei niedrigen Frequenzen (< 10 kHz), besteht.
 

Es wurde ein tragbares, eingebettetes System für Messungen des freien Säuregehalts von Olivenöl vor Ort entworfen und gebaut. Das Gerät hat eine Größe von 11 x 15 x 5 cm und kann über einen USB-Anschluss oder mit Batterien (3 AAA-Alkalibatterien 1,5 V) betrieben werden. Die Elektronikkarte, auf der Grundlage des Mikrocontrollers STM32L152RCT6A von ST Microelectronics, integriert einen LCD-Bildschirm für die Ausgabe der Messergebnisse, vier Tasten zur Benutzerinteraktion und die gesamte Elektronik für die elektrischen Messungen (elektrische Messungen der Leitfähigkeit bei 200 Hz). Die Emulsion (15 ml hydroalkoholische Lösung und 1 ml Olivenöl) befindet sich in einem 50 ml Fläschchen, das so geändert wurde, dass es eine Reihe von Elektroden aus Edelstahl (Durchmesser 6 mm, Abstand 12 mm) für die elektrischen Messungen enthält. Das Gerät wurde kalibriert und die Kalibrierkurve im Speicher des Mikrocontrollers gespeichert. Das Gerät kann die Messungen des freien Säuregehalts in etwa 30 Sekunden durchführen.
 

Nach der Kalibrierung wurde das System intern bewertet, indem Messungen an einem Satz von 30 Proben von Olivenöl unterschiedlicher Herkunft mit freien Säurewerten zwischen 0,18 und 4,5 durchgeführt wurden (Grossi, M.; Palagano, R.; Bendini, A.; Riccò, B.; Servili, M.; García-González, D. L.; Toschi, T. G.; Design and in-house validation of a portable system for the determination of free acidity in virgin olive oil. Food Control, 2019, 104, 208-216). Die Genauigkeit des Systems wurde durch einen Vergleich der Ergebnisse des Geräts mit den Ergebnissen der offiziellen Methode bewertet. Dabei wurde ein zufriedenstellender Zusammenhang mit der offiziellen Methode gefunden (R_adj = 0,97) und es wurden zufriedenstellende Ergebnisse in Bezug auf LOD, LOQ, Präzision und Genauigkeit erzielt.

Laborvergleichsuntersuchungen

Paul Brereton (Queen’s University Belfast)
 

In den letzten Monaten des OLEUM-Projekts wurden zahlreiche Daten analysiert. Insgesamt machte der Aufwand bei der Datenaquise das OLEUM-Projekt zu einem der weltweit größten Laborvergleichsuntersuchungen. Genau genommen handelt es sich um eine Reihe von Studien, die 8 verschiedene Analysemethoden mit etwa 15 Laboratorien für jede Methode umfassen, die 10 Testmaterialien analysieren, was sich im Endeffekt auf über 1000 Datensätze summiert. Zusätzlich haben einige Methoden zwei Analyten und zwei von ihnen haben sogar 18 Analyten, was in diesen Fällen über 5000 Ergebnisse ergibt, die analysiert werden müssen.
 

Die untersuchten Methoden sind:

     1. Analyse der polaren Phenole zur Bewertung der gesundheitsbezogenen Angaben von Olivenöl

     2. Analyse von freien und veresterten Sterolen bei illegalen Olivenölmischungen

     3. Verbesserte Methode für Fettsäureethylester zur Bekämpfung illegaler Verarbeitung oder minderwertiger nativer Olivenöle

     4. Eine Gruppe von Methoden, die sich mit sensorischen und flüchtigen Analysen der Qualität und Authentizität von nativem Olivenöl beschäftigen 

          a. Analyse ausgewählter flüchtiger Verbindungen in nativem Olivenöl durch Gaschromatographie

               i. GC-MS

               ii. GC-FID  

          b. Analyse des flüchtigen Fingerabdrucks von nativem Olivenöl durch SPME-GC-MS und Chemometrie, als Screening-Methode zur Unterstützung des Panel-Tests

          c. Sensorische Analyse von nativen Olivenölen unter Verwendung von zwei Referenzmaterialien
 

Die oben genannten Methoden liegen in Bereichen von leichten Verbesserungen bestehender Methoden, z.B. Methoden 2 & 3, bis hin zu neuen fortschrittlichen Multi-Analytik/Profilierungsverfahren, mit dem Ziel, den offiziellen Panel-Test (sensorische Analyse) zu ergänzen.
 

Nach einer Vorstudie, die in der ersten Hälfte von 2020 durchgeführt wurde, fand der Großteil der Hauptstudie, der „Trial Proper“, dann im Herbst 2020 statt. Jedes teilnehmende Labor erhielt für jede der oben genannten Methoden eine Standardarbeitsanweisung und einen Satz an Proben (in der Regel 10 Testmaterialien und eine Übungsprobe mit bekanntem Wert) zur einmaligen Analyse. Die Testmaterialien bestanden, ohne dass die Teilnehmer davon wussten, in Wirklichkeit aus 5 Sätzen von Duplikat-Testmaterialien, die es uns ermöglichen, die Präzision innerhalb eines bestimmten Labors und zwischen den Labors zu berechnen. Nach einer durchgeführten Statistik nach international anerkannten Standards können die untersuchten Methoden daraufhin auf ihre Tauglichkeit als offizielle Methoden beurteilt werden.
 

Die formellen Ergebnisse werden verfügbar sein, sobald wir die Ergebnisse mit den Teilnehmern geteilt und die Studie formell abgeschlossen ist. Einige der Verfahren werden dann als offizielle Methoden vorgeschlagen.

Die Revolution der Qualitäts- und Echtheitskontrolle von OLEUM

Von Nachhaltigkeit zu Big Data für Compliance
 

Von Tullia Gallina Toschi
 

Das OLEUM-Projekt ist mit einer öffentlichen Abschlusskonferenz am 17. und 18. Februar abgelaufen, die in Form von Videos auf der Website des Projekts heruntergeladen werden kann. Die Ziele des Projekts waren pragmatisch. OLEUM wollte die möglichen Qualitätsmerkmale von Olivenölen nicht umfassend untersuchen, unabhängig von den Kosten und der tatsächlichen Verfügbarkeit der Instrumente in den Qualitätskontrolllabors. OLEUM wollte neue Methoden ermitteln, die unter den gegebenen Bedingungen anwendbar sind, oder Zeit, Lösungsmittel und Verbrauchsmaterialien der bereits gesetzlich anerkannten Methoden reduzieren. Die Stichworte dabei waren „erneuern“ oder „überarbeiten“. Heute ist die Bedeutsamkeit der Verbindung zwischen dem Projekt und den grundlegenden Elementen der Nachhaltigkeit offensichtlich. Der Forschungsvorschlag von OLEUM, der am 26. Juni 2014 an die Kommission gesendet wurde, antizipierte beispielsweise auf einige Zielvorgaben des Ziels 12 der 2030-Agenda, die im September 2015 von der UNO angenommen wurde, wie die Notwendigkeit, die Freisetzung, das Nicht-Recycling oder die Verschwendung von Chemikalien zu reduzieren (Zielvorgabe 12.4), und von diesem Standpunkt aus lässt sich der Ansatz von OLEUM auf viele andere Lebensmittel ausweiten.
 

Der andere grundlegende Aspekt des Projekts war die Kombination von Prävention und Kontrolle. Alle Interessensvertreter, die an der Qualität eines so wertvollen Lebensmittels wie extra nativem Olivenöl (EVOO) beteiligt sind, kamen an einem Tisch zusammen: kleine oder mittlegrosse Primärerzeuger, die ein Interesse daran ahebn, dass das Öl fair vergütet wird; große Produzenten oder Abfüller, die auf eine  höhere Marge hoffen und die auf dem Markt zwangsläufig unterschiedliche Qualitäten und Preise anbieten müssen, die sich selbst aber nicht weiterhin in Zuständen der Nichteinhaltung und unterhalb der gesetzlichen Qualität wiederfinden wollen, und öffentliche Kontrolllabore, die Kontrollen mit hochdiagnostischen, robusten, schnellen, effektiven und harmonisierten Methoden auf allen Gebieten durchführen müssen und wollen. Und zu guter Letzt der Verbraucher, der über ein weit verbreitetes, aber im Wesentlichen wenig bekanntes Produkt informiert werden muss und dafür Qualitätsgarantien wünscht. Aus diesem Grund hat sich OLEUM in zwei Richtungen bewegt: Die Entwicklung von schnellen Screening-Methoden, die für die Prävention und die Qualitätskontrolle in den Unternehmen nützlich sind, und parallel dazu und in enger Beziehung mit hochsensiblen und spezifischen Methoden, die den Standardtabellen zur Annahme bei öffentlichen Qualitätskontrollen vorgeschlagen werden sollen.
 

Eines der Probleme war die sensorische Qualität. Die sensorische Qualität stellt eine der drei Grundpfeiler der EVOO-Qualität dar, zusammen mit den strengen Elementen der „Frische“ (die als Qualität des Öls zur Nullzeitposition definiert werden kann) und der Unversehrtheit der Ausgangsoliven. Die technologische Spezifität, dass es sich bei EVOO um ein nur gepresstes, zentrifugiertes und gefiltertes (nicht raffiniertes) Produkt handelt, ist eine wichtige Qualität, die dieses Öl mit nativem Öl (VOO) teilt, das nicht über so strenge Bestimmungsfaktoren der vorherigen Qualität verfügt. Ohne eine einwandfreie sensorische Qualität gäbe es kein EVOO, auch wenn dieses Element eines der am schwierigsten zu beurteilenden ist. Es ist allgemein bekannt, dass die meisten Nichtkonformitäten sensorische Aspekte betreffen. Aus diesem Grund hat OLEUM unter Inanspruchnahme der gesamten Literatur zu diesem Thema zwei hochaufgelöste chromatographische Methoden (SPME-GC/MS und SPME-GC/FID) entwickelt und geprüft, die für öffentliche Kontrolllabore bestimmt sind und dem Internationalen Olivenölrat vorgelegt werden, damit diese Methoden übernommen werden können, sobald die Grenzwerte und Bereiche für die wichtigsten Merkmale festgelegt wurden. Diese zwei instrumentellen Methoden können bei zweifelhaften Klassifizierungen mit dem Panel-Test (sensorische Prüfung) kombiniert werden.
 

Zeitgleich wurden dieselben Maßnahmen, d.h. die Mindestanzahl an flüchtigen Verbindungen, die als hochgradig diagnostisch angesehen werden (15-18 Verbindungen)reduzieren, ergriffen, um schnelle Screening-Methoden vorzuschlagen, die das EVOO-Produkt auf der Grundlage der sensorischen Qualität vorklassifizieren können. Diese Methoden sind besonders für Abfüller nützlich, um eine schnelle Entscheidung treffen zu können, ob sich der Kauf einer Charge Öl lohnen wird.
 

Die Herausforderung von OLEUM, die auch ein internationales Netzwerk, geschaffen hat, die Interessengruppen zusammenzubringen, erweitert das Fachwissen über Olivenöl und EVOO, fördert die Konkurrenzfähigkeit in Bezug auf das Produkt und Kontrollmethoden als positive Maßnahmen. Dies betrifft Maßnahmen für eine harmonisierte Authentizität und Qualität und ist darauf ausgerichtet, in der Praxis weitere Sicherheitselemente zu etablieren.
 

Auf der Projektwebsite sind alle bisher veröffentlichten und öffentlich verfügbaren Artikel gesammelt und einsehbar.
 

Die strategische Ausrichtung der EU im Bezug auf Qualitäts- und Echtheitskontrollen für Olivenöl, könnten wie folgt aussehen:

1. eine gemeinsame Strategie, um sensorische und instrumentelle Daten zu kombinieren (Kostenersparnis),
2. eine Verbesserung der Leistungsfähigkeit und der Ausrichtung durch reproduzierbare Referenzmaterialien (RMs),
3. reale und virtuelle Zusammensetzungen in einem Projektarchiv mit validierten Daten (z.B. OLEUM-Datenbank) umgesetzt und gespeichert werden, sodass diese als Authentizitätsreferenz dienen koennen,
4. OO-Qualitäts- und Authentizitätsinformationen in Beziehung setzen mit den produzierten Mengen und deren Geolokalisierung. Die Schnittstelle zwischen amtlichen Qualitätskontrollen und Rückverfolgbarkeit, die für Blockchain-Szenarien typisch ist, könnte als nächste Betrugsbekämpfungsmaßnahme verwendet werden.

Conférence finale du projet OLEUM

Les 17 et 18 février 2021, le projet OLEUM a tenu avec succès sa conférence finale. Au total, plus de 400 personnes de différents domaines se sont inscrites à la réunion en ligne pour découvrir les résultats du projet et discuter des futures possibilités d'assurer la qualité et l'authenticité de l'huile d'olive.

L'événement a été séparé en deux jours, le premier jour étant axé sur les résultats et les impacts d'OLEUM sur l'avenir des politiques européennes en matière d'huile d'olive et le deuxième jour s'est concentré sur les outils et méthodes analytiques nouvellement développés pour garantir davantage la qualité et l'authenticité de l'huile d'olive.

Le professeur Giovanni Molari, chef du département des sciences agricoles et alimentaires de l'Université de Bologne, a souhaité la bienvenue aux participants avant que le coordinateur du projet, le professeur Tullia Gallina Toschi, donne un aperçu des résultats les plus importants du projet OLEUM et déclare que les opportunités qui en découlent sont d'un grand intérêt et extrêmement précieux pour le marché. Les résultats obtenus par le projet OLEUM sont également pris en compte dans l'élaboration des futures politiques de l'UE en matière d'huile d'olive.

"Nous devons avoir un rôle formateur sur ce qu'est l'huile d'olive et ce qu'est EVOO." - Prof Dr Tullia Gallina Toschi

Le réseau international OLEUM en croissance continue rassemble et élargit l'expertise de haute qualité dans l'analyse et l'authentification des huiles d'olive. Ainsi, conduisant à des outils et méthodes nouveaux et innovants pour lutter contre les activités frauduleuses et protéger la qualité de l'huile d'olive. Les résultats de ces méthodes peuvent être stockés dans la banque de données OLEUM qui est l'un des principaux résultats du projet et contribue à améliorer l'échange d'informations entre les différentes parties prenantes de la communauté de l'huile d'olive. En raison des nombreuses informations incorrectes sur l'huile d'olive provenant de diverses sources, il est important de fournir au public des informations fiables et scientifiques, c'est pourquoi la partie communication du projet OLEUM est d'une grande importance.

Les méthodes respectives ont été présentées et expliquées par leurs développeurs le deuxième jour de la conférence finale OLEUM. Les participants ont eu un aperçu des antécédents techniques et ont eu la possibilité de clarifier les questions des développeurs lors d'une session de questions-réponses.

Les retours à la fin de la conférence ainsi que dans le chat et via les réseaux sociaux ont été formidables et l'équipe OLEUM tient à remercier tous les participants et intervenants pour rendre cela possible!

Pour plus d'informations sur les principaux résultats du projet, les enregistrements de la conférence finale et d'autres ressources, veuillez consulter le paquet virtuel que nous avons préparé pour vous: Cliquez ici

Vous pouvez retrouver l'enregistrement de la conférence finale ici!

Le réseau OLEUM

Tassos Koidis, Paul Breton and Enrico Valli
 

Depuis notre dernière newsletter, le réseau OLEUM a connu une croissance constante, tant en termes de contenu que de membres. Nous comptons désormais 120 membres sur notre plateforme OLEUM Basecamp (augmentation de 18%) et 164 membres (augmentation de 21%) sur notre groupe la "Question du mois" d'OLEUM de notre réseau LinkedIn. Nous avons publié 3 Q&R supplémentaires (Q1 : Vrai ou faux ? Le fait de chauffer l'huile d'olive entraîne la production d'acides gras trans. Q2 : Qu'est-ce que l'huile de « remolido » ? Q3 : L'HOVE pressée à froid est-elle toujours supérieure à l'huile d'olive ordinaire ?).

Ce fut une période chargée pour certains des membres d'OLEUM qui ont mené les études de validation de méthode qui se sont terminées juste avant Noël. Les membres travaillant dans des laboratoires d'essais privés et publics, comme Jorge de Sovena, ont considéré qu'il était très utile de pouvoir accéder librement au matériel de formation des deux ateliers OLEUM qui ont eu lieu en Espagne (19 octobre) et en Italie (19 décembre) à partir des ressources du réseau OLEUM. De nombreux nouveaux étudiants ont également rejoint le réseau récemment, comme Gabriela de l'Université de Cordoue, en Espagne, qui a écrit : "J'avais besoin d'informations sur l'huile d'olive pour préparer mon projet de maîtrise de dernière année et surtout, sur la technique de chromatographie en phase gazeuse pour la classification de l'huile d'olive dans les trois catégories, vierge extra, vierge et lampante. J'ai terminé mon travail en octobre 2020, mais j'attends actuellement l'évaluation pour entrer dans un programme de doctorat dans la même université". Depuis l'annonce récente de la conférence finale d'OLEUM, les réseaux ont également reçu une nouvelle attention avec des adhésions quotidiennes. Nous, les membres du projet OLEUM, avons beaucoup d'idées sur l'avenir du réseau OLEUM, au-delà de la fin officielle du projet. Mais avant tout, nous aimerions connaître votre opinion. Rejoignez le réseau (pour LinkedIn, cliquez ici). Si vous souhaitez savoir ce dont il a été question au sujet des prochaines étapes du réseau lors de la conférence finale d'OLEUM, veuillez visionner l'enregistrement de la conférence ici.

Deux matériaux de référence sensorielle

Prof. Alessandra Bendini, Dr. Diego Luis Garcia Gonzalez, Prof. Tullia Gallina Toschi
 

Dans le cas de l'huile d'olive vierge, l'évaluation sensorielle est une méthode normalisée et, conformément aux normes du Conseil oléicole international (COI) et à d'autres réglementations nationales et internationales (règlements de l'UE, Codex Alimentarius), son application est obligatoire pour établir d'éventuelles catégories de qualité (par exemple, pour l'UE : vierge extra, vierge, lampante) et pour le marketing du produit. 
 

Les laboratoires qui mettent en œuvre les méthodes d'analyse doivent démontrer leur compétence dans l'application des méthodes d'essai, en suivant les procédures décrites par l'UE et la COI, avec des essais qui garantissent la validité des résultats : ce processus de validation doit être effectué avec des matériaux de référence (MR). En fait, l'utilisation des MR est citée comme étant nécessaire à l'analyse sensorielle par la réglementation actuelle (COI/T.28/Doc.no.1/Rev.4 ; COI/T.20/Doc.no.14/Rev.5). 
 

L'utilisation de matériaux de référence (MR) pour lesquels des valeurs numériques définitives peuvent être associées à différents attributs sensoriels est absolument nécessaire pour calibrer le dispositif de mesure, aider les experts à mémoriser les stimuli sensoriels, et comparer leur jugement avec les "valeurs indiquées" et ainsi améliorer leurs capacités individuelles. Pour ces raisons, les MR doivent être utilisés pour la supervision continue des jurys ainsi que pour les études de contrôle intra-jury et inter-jurys. En outre, les MR pourraient également se montrer très utiles pour la sélection et la formation de nouveaux dégustateurs recrutés lors de nombreux cours organisés aux niveaux national et international par différentes organisations et portant sur la formation spécifique des experts sensoriels des huiles d'olive vierges. 
 

Pour l'analyse sensorielle des HOV, à l'heure actuelle, seuls des MR provenant de matrices naturelles (huiles d'olive authentiques utilisées comme échantillons de référence pour les défauts sensoriels fournis par le COI, échantillons provenant de tests d'aptitude ou certifiés par au moins trois jurys sensoriels accrédités) sont disponibles pour la formation des jurys sensoriels ; ils sont efficaces car ils ressemblent à des échantillons réels, bien que leur utilisation soit limitée dans le temps (par exemple, disponibilité limitée, difficile à obtenir, faible homogénéité d'année en année).
 

Des MR simulant les arômes des défauts vineux-vinaigré et rance ont été formulés à des dilutions spécifiques par le CSIC, en utilisant une collection de composés volatils synthétiques dilués dans une huile d'olive raffinée sans saveur à des concentrations spécifiques (Aparicio-Ruiz et al., 2020, Foods, 9(12), 1870), puis l'UNIBO a coordonné leur évaluation sensorielle au sein du consortium OLEUM (six jurys ont été impliqués) ainsi que dans le contexte de la validation inter-labos qui vient de se terminer (phases pré-test et essai à proprement parler).
 

Les principaux résultats de la validation interlaboratoires ont été les suivants :
 

L'évaluation de la représentativité des matériaux de référence (RM1 et RM2), en termes d'évaluation par les membres du jury de leur "utilité pour imiter les défauts sensoriels à caractère vineux-vinaigré et rance" : les données reçues ont démontré que les MR étaient évalués comme appropriés par une forte proportion d'utilisateurs finaux. 
 

Le calcul des intensités perçues des défauts vineux-vinaigré et rance (RM1 et RM2) car la définition de l'intensité de chaque MR sensoriel est une information fondamentale pour permettre son utilisation future éventuelle dans la formation des dégustateurs : l'alignement entre les jurys en ce qui concerne l'intensité du défaut dans chaque MR a été atteint.

Logiciel permettant d’estimer la date limite de consommation des HOVE

Par Maurizio Servili et Tullia Gallina Toschi

Le niveau et le taux de détérioration de la qualité des HOVE sont fortement influencés par leur composition chimique et leurs conditions de stockage (emballage, température et exposition à la lumière), et il a été largement démontré que cette détérioration peut être extrêmement variable en fonction de ces facteurs. La date limite de consommation (DLC) d'une HOVE à indiquer sur l'étiquette (c'est-à-dire la période minimale de stockage pendant laquelle les huiles d'olive vierges conservent leurs paramètres chimiques et sensoriels dans les limites correspondantes à la catégorie déclarée) dépend de la décision du producteur et la seule autre information objective sur l'âge de l'huile qui peut être écrite (si 100 % du contenu du récipient provient de cette récolte), est l'année (ou le mois) de récolte. 
 

Comment les producteurs peuvent-ils fournir une DLC fiable pour leur HOVE, sur une base scientifique, puisqu'ils n'ont actuellement aucune méthode objective pour se repérer ? La disponibilité d'un outil permettant de déterminer la DLC et son utilisation préventive représenterait la meilleure tactique de défense contre la perte de confiance des consommateurs et le risque d'accusations de fraude. 
 

Pour combler cette lacune, dans le cadre du projet Oleum, un logiciel capable de prédire la DLC d'une HOVE donnée dans des conditions de stockage spécifiques a été développé et validé. 
 

Pour atteindre l'objectif final, des modèles de prédiction ont été construits sur la base d'une vaste base de données analytiques, produite en suivant l'évolution de paramètres analytiques sélectionnés dans le cadre d'une expérience de durée de conservation en temps réel sur 20 échantillons d'HOVE, choisis selon le plan D-optimal en utilisant l'algorithme du composé le plus descriptif (MDC - Most Descriptive Compound), afin de parcourir le domaine expérimental avec des huiles caractérisées par des combinaisons de concentrations faibles, moyennes et élevées d'acides gras, de phénols hydrophiles et de tocophérols sélectionnés.
 

Ces 20 échantillons d'HOVE ont été entièrement caractérisés analytiquement quant à leurs paramètres de qualité réglementés, leur profil d'acides gras, leurs antioxydants (phénols hydrophiles et tocophérols), leur composés volatils, leurs DAG et leurs OSI, ils ont ainsi été embouteillés en verre de qualité UVA, placés sur des étagères pendant 12 mois à la lumière (pour 12 h/jour ; 25 °C) et pendant 24 mois dans l'obscurité (25-30-35 °C). L'échantillonnage et les analyses ont été effectués mensuellement pour l'exposition à la lumière et tous les deux mois pour les essais à l'obscurité.
 

Les paramètres analysés pendant la durée de conservation en temps réel pour la construction du modèle étaient les suivants : acidité, indice de peroxyde, K232, K270, ∆K, phénols hydrophiles, α-tocophérol, composés volatils et composition des acides gras. 
 

L'ensemble des données obtenues à partir des résultats d'analyse a été utilisé pour construire deux modèles prédictifs différents, l'un pour l'exposition à la lumière et l'autre pour les conditions de stockage dans l'obscurité.
 

Ces modèles prédictifs ont été construits par une approche statistique multivariée et les coefficients permettant de calculer le temps restant pour atteindre les valeurs seuils de certains paramètres réglementaires/qualité, afin de déterminer les DLC, ont été extrapolés à travers les deux modèles. 
 

La capacité de prédiction a été évaluée par une validation interne et externe, montrant une précision satisfaisante dans la prévision de la date à laquelle les paramètres réglementaires et/ou de qualité les plus importants seront dépassés (en termes de K270, la concentration de phénols hydrophiles, le seuil d'impact des composés volatils pour le rancissement).
 

Le logiciel a été développé avec une interface intuitive, de sorte que les paramètres d'entrée pour prédire la DLC d'une HOVE sont : le nom de l'échantillon, les conditions de stockage (lumière/obscurité et température), et une sélection de paramètres analytiques. Le résultat est représenté par le temps restant avant le dépassement de la valeur seuil (en mois). La précision de la prédiction de la DLC est satisfaisante dans le but de fournir un outil répondant aux besoins des producteurs et pour renforcer la confiance des consommateurs. 

Solutions de références étalons à utiliser pour l’analyse des composés volatils

Les attributs sensoriels positifs et négatifs des huiles d'olive vierges (HOV) dépendent strictement de la composition des fractions volatiles. À ce jour, l'évaluation organoleptique des huiles d'olive vierges, en termes de présence et d'intensité de ces attributs sensoriels, est réalisée selon une méthode appelée "jury sensoriel". Étant donné que des désaccords sont possibles quant à la classification des HOVs par différents jurys, une confirmation/infirmation provenant des analyses qualitative et quantitative de composés organiques volatils (COV) spécifiques responsables des défauts ou des attributs positifs, revêt une grande importance. Dans ce contexte, le projet OLEUM a proposé des méthodes d'analyse des composés volatils dans les HOV basées sur différentes techniques d'analyse : des analyses SPME-GC-FID et SPME-GC-MS les plus robustes, aux HS-GC-IMS les plus innovantes, ces dernières plus adaptées à un screening, qui peuvent être utilisées pour la classification de chaque HOV dans leur catégorie de qualité (extra vierge, vierge et lampante). 

Une analyse instrumentale qualitative et quantitative des composés volatils peut être utile pour étayer les résultats des jurys sensoriels, en outre, une fois les signaux/marqueurs validés, pour établir les limites de concentration des composés pertinents, décrivant le défaut organoleptique, pour les différents classements de qualité. Sur la base des analyses effectuées dans le cadre du projet OLEUM, 18 composés volatils ont été sélectionnés dans le but de disposer d'un ensemble avec un nombre minimum de composés hautement représentatifs et facilement disponibles sur le marché. Ils ont été regroupés en deux matrices étalons (SMA et SMB), dissoutes dans de l'huile d'olive raffinée, afin de réduire considérablement le nombre d'analyses pour la préparation des courbes d'étalonnage. La sélection des 18 composés volatils dans les mélanges SMA ou SMB a été basée : i) sur leur présence habituelle dans les HOV (concentration élevée ou faible) et ii) sur la nécessité de limiter les redondances éventuelles entre les composés, qui rendraient difficile l'intégration des pics, facilitant ainsi la comparaison interlaboratoire des résultats.
 

Les mêmes mélanges peuvent également être utilisés comme matériel d'étalonnage pour mettre au point des méthodes de screening rapide ; comme cela a été récemment publié dans Foods, au moins 15 des 18 composés volatils peuvent être élués et détectés par un HS-GC-IMS. La composition de ces matrices a été présentée lors de certains événements publics et est décrite en détail dans un autre article scientifique publié dans Food Control.

Instrument basé sur la technique RDT pour la détection des mélanges d’HOVE avec des huiles d’olive soft-désodorisée

La réflectométrie à domaine temporel (RDT) est une technique bien connue utilisée dans plusieurs domaines : vérification des discontinuités dans les lignes électriques, détermination de l'humidité du sol, caractérisation diélectrique des matériaux alimentaires et non alimentaires. La RDT est basée sur la réponse de la matière à une impulsion électromagnétique qui prend un certain temps à se déplacer et à être réfractée, et qui change de forme en fonction de la composition physico-chimique et structurelle du matériau. Plus l'échantillon est petit, plus l’impulsion électromagnétique doit être rapide.

Les huiles d'olive vierges extra (HOVE) et les huiles d'olive soft-désodorisées (HOsd) sont chimiquement différentes : par exemple, elles ont une teneur différente en esters éthyliques d'acides gras (EEAG). Les techniques d'analyse classiques pour déterminer les EEAG sont complexes, longues et nécessitent des réactifs chimiques. Dans le contexte OLEUM, la possibilité de déterminer la teneur en EEAG et de distinguer les mélanges d'HOVE et d’HOsd avec la RDT a été étudiée. L'instrumentation utilisée a permis de générer et d'acquérir la forme d'onde des impulsions avec un temps de montée de l'ordre de quelques dizaines de picosecondes et, par conséquent, une sonde pour quelques ml d'échantillon a pu être utilisée. 

La forme des signaux réfléchis a été analysée par une analyse multivariée. La régression des moindres carrés partiels (PLS) a été utilisée pour construire des modèles prédictifs du contenu en EEAG et l'analyse discriminante PLS (PLS-DA) a été appliquée pour distinguer les mélanges. La teneur en EEAG a été prédite avec une régression caractérisée par un coefficient de détermination (R2) d'environ 0,81 et avec une erreur quadratique moyenne (RMSE) de l'ordre de 10 mg/kg. Les mélanges d'HOVE et d’HOsd ayant une teneur en EEAG supérieure ou inférieure à une limite choisie (35 mg/kg) ont tous été correctement classés. Bien que les résultats obtenus doivent être corroborés par des tests de confirmation tenant compte de variables, telles que la température, qui peuvent avoir une influence sur la précision, la technique semble prometteuse, du moins pour un contrôle préliminaire. 

Aujourd'hui, les mesures avec la RDT, comme celles qui sont effectuées ici, nécessitent des instruments génériques, multifonctionnels et coûteux (par exemple un oscilloscope) et du personnel qualifié en matière de mesures électroniques et d'analyse statistique des données. Dans le cadre d’une diffusion sur le marché d'un instrument pour les déterminations de EEAG, il sera certainement nécessaire de combiner les dispositifs et d'automatiser les procédures de calibrage et les fonctions d'analyse dans un outil dédié et pas trop coûteux. La mise en œuvre et la commercialisation d'un tel dispositif, d'un coût d'environ trois mille euros, pour les tests de dépistage pourraient être intéressantes pour les entreprises qui fabriquent des instruments d'analyse.

La base de données OLEUM

Tatyana Dimitrova, Alain Maquet, Viet Mai Hoang, Arantza Respaldiza, Alexander Kerner
 

Un inventaire des bases de données existantes sur les olives et les huiles d'olive a mis en évidence la rareté de tels systèmes (par exemple le système ISAMM pour les contrôles de conformité des huiles d'olive géré par la CE) pour contrôler l'authenticité de ce produit alimentaire. Les consultations auprès des parties prenantes, y compris des organismes de contrôle nationaux, ont confirmé la rareté de ces banques de données, ce qui renforce l'intérêt pour un système commun, partagé entre les États membres et fondé sur des méthodes d'analyse harmonisées.
 

Au cours du projet, la base de données OLEUM a été construite comme une plate-forme d'accès web innovante pour stocker les documents et les données analytiques validées générés par le consortium OLEUM. Ce système est développé en utilisant uniquement des technologies modernes et open-source offrant beaucoup de flexibilité. La base de données OLEUM peut être considérée comme constituée de trois modules de base - répertoire, base de données et outil de recherche - avec une gestion sophistiquée des rôles et des accès pour les utilisateurs.
 

La fonction répertoire est dédiée au stockage de documents (dans n'importe quel format comme pdf, doc, xls, etc.) avec des métadonnées décrivant chaque document comme le titre du document, le(s) auteur(s), la date de création, la date de téléchargement dans le répertoire, une courte description, l'objectif, la catégorie, le statut, la politique d'accès. Les métadonnées sont utilisées dans l'option de recherche du dépôt d'archives. L'utilisateur qui télécharge le fichier dans le dépôt d'archives décide de la politique d'accès à appliquer au document. Actuellement, les documents peuvent être stockés sous forme de fichier de calcul, de modèle de fichier de rapport, de procédure opérationnelle standard (POS), de spécification d'un matériau de référence, de rapport de validation. Ce module prend en charge le contrôle de version, de sorte qu’une POS mise à jour peut être retracée lorsqu'elle est référencée lors d’une expérience.
 

La fonction base de données est structurée de manière à gérer, suivre et tracer les expériences. En résumé, un utilisateur construit une expérience en sélectionnant les participants, les techniques qu'ils utiliseront, les échantillons à analyser, les mesurandes liés aux techniques sélectionnées et crée le modèle de rapport incluant les métadonnées de ces entités et les mesurandes à rapporter par les participants. Le système est très flexible et permet aux utilisateurs de modifier, ajouter, et définir des descripteurs obligatoires et facultatifs pour toutes les entités existantes et nouvelles. Le revers de cette flexibilité est un contrôle strict des modifications des métadonnées afin d'éviter une multitude de variantes dans les métadonnées. Cette structure vise à permettre à tout utilisateur non impliqué dans une expérience de comprendre, grâce à toutes les métadonnées, tous les détails sur les objectifs, les conditions et les résultats de la ou des expériences qui l'intéressent. Par exemple, les métadonnées d'un échantillon décrivent soit un échantillon de référence (les informations sont authentifiées depuis l’oliveraie jusqu'à l’embouteillage de l'huile), soit un échantillon de confiance (une grande quantité d'informations est traçable), soit un échantillon expérimental (informations disponibles sur un produit plus difficilement vérifiable), y compris les données obligatoires / volontaires mentionnées dans les règlements communautaires concernés. Il convient de préciser qu'outre l'huile d'olive, d'autres huiles comestibles peuvent être enregistrées. Potentiellement, toutes les méthodes d'analyse peuvent être traitées avec des métadonnées appropriées, y compris les méthodes proposées par le projet OLEUM mais aussi celles utilisées par les États membres pour vérifier la conformité des huiles d'olive.
 

Le module de recherche permet à l'utilisateur de rechercher n'importe quel mot clé dans l'ensemble de la base de données OLEUM, dans chaque catégorie de données de types différentes - documents, échantillons, séries d'échantillons, expériences, résultats et techniques. Il est très puissant et permet à l'utilisateur d'explorer les données disponibles dans la base de données. Les résultats de la recherche sont présentés dans un tableau flexible qui est utilisé pour la visualisation et qui permet de sélectionner les champs à visualiser, d'appliquer différents filtres, de dimensionner les colonnes, de trier chaque champ, etc. Le contenu de chacun de ces tableaux peut être exporté sous la forme d'un simple fichier csv et analysé localement sur l’ordinateur d’un 'utilisateur.
 

Sur le court terme, la base de données sera ouverte au public qui aura besoin d’être préalablement enregistré pour recevoir ses droits d’accès en fonction de son rôle. Certains utilisateurs pourront donc enregistrer de nouveaux résultats et exploiter la base de données, afin de démontrer la capacité de diagnostic de certaines méthodes/mesures analytiques permettant de détecter les huiles d'olive adultérées. À moyen terme, en fonction de l'intérêt des organismes de contrôle nationaux, l'accès pourrait leur être limité pour des raisons de confidentialité.

Méthode rapide de spectroscopie de fluorescence pour détecter la quantité de composés phénoliques lipophiles bioactifs (tocophérols ou vitamine E)

Les huiles d'olive fraîches contiennent une quantité variable de tocophérols, des molécules phénoliques lipophiles dotées de propriétés antioxydantes et vitaminiques (en particulier, l'alpha-tocophérol est un composé capable de jouer le rôle de vitamine E).
 

Cependant, comme ces composés sont sensibles à l'oxydation, leur niveau diminue lors du stockage de l'huile (en fonction des conditions adoptées et de la composition naturelle de l'échantillon d'huile).
 

L'analyse fluorescente des huiles d'olive tire parti de la présence de composants fluorescents naturels (par exemple, les chlorophylles et leurs dérivés), y compris les tocophérols.
 

L'analyse des spectres fluorescents des échantillons d'huile d'olive a été réalisée à l'aide d'un instrument équipé d'un lecteur de plaques noires à 96 puits.
 

Les mesures (excitation à 302 nm et émission à 328 nm) ont été effectuées en transférant directement une petite quantité d'échantillon d'huile (250 µl) sans traitement supplémentaire (comme la dilution et l'extraction, voir Figure 1).
 

Les résultats des analyses de fluorescence d'échantillons d'huile d'olive réalisées à l'aide de cet outil se sont révélés être en forte corrélation avec la quantification par CLHP de la teneur en alpha-tocophérol (voir Figure 2) et cette méthode a été validée en interne avec succès (par exemple en termes de paramètres comme la précision, l'exactitude, la LD, la LOQ, la robustesse).
 

Cette approche peut permettre un criblage rapide et à haut débit de la quantité totale de tocophérols dans les échantillons d'huile d'olive avec pratiquement aucune préparation de l'échantillon.
 

Figure 1 : Diagramme de flux du test - 250 µl d'huile d'olive vierge sont transférés dans une plaque de 96 puits et soumis à une analyse spectroscopique par fluorescence.

Figure 2 : Corrélation entre les concentrations d'alpha-tocophérol déterminées par un test spectroscopique de fluorescence et par la méthode de référence HPLC-FLD.

Système portable à piles pour la détermination de l’acidité libre dans l’huile d’olive vierge

La qualité de l'huile d'olive est influencée par différents facteurs tels que le processus d'extraction et le stade de maturation des fruits, ainsi que les conditions de stockage (lumière et température). Un certain nombre de paramètres (par exemple, l'acidité libre, l'indice de peroxyde), ainsi que des attributs sensoriels, sont évalués pour déterminer la qualité de l'huile d'olive. L'acidité libre est le premier et le plus important des paramètres permettant de déterminer la qualité de l'huile et la méthode officielle pour sa détermination est un titrage chimique qui doit être effectué dans un laboratoire par un personnel qualifié.
 

Ce projet vise à développer une nouvelle technique pour la détermination de l'acidité libre de l'huile d'olive afin qu'elle puisse être facilement mise en œuvre avec un système électronique portable pour des mesures rapides et précises sur le terrain par des opérateurs sans formation spécifique. Cela permet même aux plus petits centres de production (huileries et centres de conditionnement) qui ne peuvent pas se permettre un laboratoire d'analyse interne d'effectuer des mesures d'acidité libre in situ sans les coûts et les délais associés à l'envoi de l'échantillon à un laboratoire externe.
 

Le principe de fonctionnement de la mesure est basé sur la spectroscopie d'impédance électrique (SIE), une technique où une tension sinusoïdale est appliquée à l'échantillon testé et ses caractéristiques électriques sont mesurées dans une gamme de fréquences. Dans ce cas, l'échantillon testé est une émulsion entre une solution hydroalcoolique (éthanol 60%, eau distillée 40%) et l'échantillon d'huile d'olive. Des études préliminaires ont été réalisées à l'aide d'un analyseur d'impédance commercial (Agilent E4980A) dans la gamme de fréquences 20 Hz - 2 MHz. Les résultats ont montré qu'il existe une corrélation entre l'acidité libre de l'huile et la conductance électrique de l'émulsion mesurée à basse fréquence (< 10 kHz).
 

Un système embarqué portable pour les mesures in-situ de l'acidité libre de l'huile d'olive a été conçu et construit. L'instrument a une taille de 11 x 15 x 5 cm et peut être alimenté par un port USB ou par des piles (3 piles alcalines AAA de 1,5 V). La carte électronique, basée sur le microcontrôleur STM32L152RCT6A de ST Microelectronics, intègre un écran LCD pour la visualisation des résultats de mesure, quatre boutons pour l'interaction avec l'utilisateur et toute l'électronique pour les mesures électriques (mesures de conductance électrique à 200 Hz). L'émulsion (15 ml de solution hydroalcoolique et 1 ml d'huile d'olive) est contenue dans un flacon Falcon de 50 ml modifié de manière à pouvoir accueillir deux électrodes en acier inoxydable (diamètre 6 mm, espacées de 12 mm) pour les mesures électriques. L'instrument a été calibré et la courbe de calibrage a été enregistrée dans la mémoire du microcontrôleur. L'instrument peut effectuer des mesures d'acidité libre en 30 secondes environ.
 

Après étalonnage, le système a été validé en interne en effectuant des mesures sur un ensemble de 30 échantillons d'huile d'olive de différentes origines avec des valeurs d'acidité libre comprises entre 0,18 et 4,5 % (Grossi, M. ; Palagano, R. ; Bendini, A. ; Riccò, B. ; Servili, M. ; García-González, D. L. ; Toschi, T. G. ; Design and in-house validation of a portable system for the determination of free acidity in virgin olive oil. Food Control, 2019, 104, 208-216). La précision du système a été évaluée en comparant les résultats de l'instrument avec les résultats de la méthode officielle. Une bonne corrélation a été trouvée avec la méthode officielle (R_adj = 0.97) et des résultats satisfaisants ont été obtenus en termes de LOD, LOQ, précision et exactitude.

Études interlaboratoires

Paul Brereton (Université Queen's de Belfast)
 

Durant les derniers mois de l'activité OLEUM, tous les partenaires du projet ont été très occupés à analyser les données - beaucoup de données. En effet, nous sommes en train de terminer l'une des plus grandes études interlaboratoires au monde. Il s'agit en fait d'un ensemble d'études, impliquant 8 méthodes d'analyse différentes avec environ 15 laboratoires pour chaque méthode, analysant 10 matériaux de test, soit plus de 1000 points de données. En outre, certaines méthodes comportent deux analytes et deux d'entre elles en comportent 18 (!), ce qui porte à plus de 5000 le nombre de résultats à analyser !
 

Les méthodes étudiées sont les suivantes :

     1. Analyse des phénols polaires, utilisée pour évaluer l'allégation de santé concernant l'huile d'olive

     2. Analyse des stérols libres et estérifiés ciblant les mélanges illégaux d'huiles d'olive

     3. Méthodologie améliorée pour les esters éthyliques d'acides gras ciblant la transformation illégale ou l'huile d'olive vierge de qualité inférieure

     4. Un groupe de méthodes d'analyses sensorielle et de composés volatils mesurant la qualité et l'authenticité de l'huile d'olive vierge

          a. Analyse de composés volatils sélectionnés dans l'huile d'olive vierge par chromatographie en phase gazeuse

               i. GC-MS

               ii. GC-FID 

          b. Analyse de l'empreinte digitale en composés volatils de l'huile d'olive vierge par SPME-GC-MS et chimiométrie, comme méthode de contrôle à l'appui du test de dégustation

          c. Analyse sensorielle des huiles d'olive vierges à l'aide de deux matériaux de référence
 

Certaines des méthodes susmentionnées comprennent de légères améliorations des méthodes existantes, par exemple les méthodes 2 et 3, d’autres méthodes sont de nouvelles procédures avancées de profilage et d'analyse multiple qui visent à compléter le jury de dégustation officiel (analyse sensorielle).
 

Suite à une étude préliminaire menée au cours du premier semestre 2020, la majeure partie de l'étude principale, le "test à proprement parler", a eu lieu à l’automne 2020. Pour chacune des méthodes ci-dessus, chaque laboratoire participant a reçu un mode opératoire standardisé et un ensemble d'échantillons (généralement 10 matériaux à analyser et un échantillon d’étalonnage avec une valeur connue) à analyser une seule fois. Sans que les participants ne le sachent, les matériaux de test comprenaient en fait 5 ensembles de matériaux à analyser en double qui nous ont permis de calculer la fidélité au sein du laboratoire et entre les laboratoires. Après avoir effectué des statistiques selon des normes internationalement reconnues, les méthodes étudiées peuvent ensuite être évaluées pour déterminer si elles conviennent effectivement à l’utilisation en tant que méthodes officielles.
 

Les résultats officiels seront bientôt disponibles une fois que nous aurons partagé les résultats avec les participants et officiellement clôturé l'étude. Certaines des procédures seront alors proposées comme méthodes officielles.
 

Nous voudrions profiter de cette occasion pour remercier tous les laboratoires qui ont participé à cet énorme exercice et l'ont fait dans des circonstances extrêmement difficiles (Covid-19).

La révolution du contrôle de la qualité et de l’authenticité OLEUM

De la durabilité aux big data pour la conformité

Par Tullia Gallina Toschi
 

Le projet OLEUM s'est terminé avec une conférence publique finale, qui s'est déroulée sur deux jours, le 17 et 18 février et qui est disponible en vidéos téléchargeables sur le site web du projet. Les objectifs du projet étaient pragmatiques. OLEUM ne voulait pas étudier en profondeur les indicateurs de qualité possibles des huiles d'olive, indépendamment du coût et de la disponibilité réelle des instruments dans les laboratoires de contrôle de la qualité. OLEUM voulait identifier de nouvelles méthodes applicables dans les conditions existantes ou réduire le temps, les solvants et les consommables utilisés dans les méthodes déjà légalement reconnues. Les mots clés ici étaient "renouveler" ou "réviser". Aujourd'hui, l'importance du lien entre le projet et les principes fondamentaux relatifs aux problèmes de durabilité est évidente. La proposition de recherche OLEUM, envoyée à la Commission le 26 juin 2014, anticipait, par exemple, certains buts de l'objectif 12 de l'agenda 2030, adopté par l'ONU en septembre 2015, comme la nécessité de réduire les rejets et le non-recyclage ou le gaspillage de produits chimiques (objectif 12.4) et, de ce point de vue, l'approche OLEUM peut être appliquée à de nombreux autres aliments.
 

L'autre aspect fondamental du projet était la combinaison de la prévention et du contrôle. Tous les acteurs de la qualité d'un aliment aussi précieux que l'huile d'olive vierge extra (HOVE) ont été placés à la même table : les petits ou moyens producteurs, qui veulent que l'huile soit rémunérée équitablement; les grands producteurs ou embouteilleurs, qui ont besoin d'une marge supplémentaire et qui doivent nécessairement offrir au marché des qualités et des prix différents, mais qui ne veulent plus se retrouver dans des conditions de non-conformité et en dessous de la qualité légale et les laboratoires de contrôle officiels qui doivent et veulent effectuer des contrôles avec des méthodes hautement analytiques, robustes, rapides, efficaces et harmonisées sur tous les territoires. Enfin et surtout, le consommateur, qui doit être informé sur un produit largement utilisé mais peu connu sur le fond, et qui veut des garanties de qualité. OLEUM a donc pris deux directions : développer des méthodes d’analyse rapides, utiles pour la prévention et le contrôle de la qualité dans les entreprises mais également développer des méthodes très pointues et spécifiques à proposer à la normalisation pour adoption dans les contrôles officiels de la qualité.
 

L'un des principaux problèmes était la qualité sensorielle. Elle représente l'un des trois piliers fondateurs de la qualité de l’HOVE, avec les critères rigoureux de la "fraîcheur" (qui peut être définie comme la qualité de l'huile au moment zéro) et l'intégrité des olives au départ. La spécificité technologique, étant donné que l'HOVE est uniquement un produit pressé, centrifugé et filtré (non raffiné), est une caractéristique importante, partagée avec l'huile vierge (HOV) qui n'a pas de déterminants aussi rigoureux. Sans une qualité sensorielle irréprochable, l'HOVE n'existerait pas, même si cet élément reste l'un des plus difficiles à évaluer. Il est bien connu que la plupart des non-conformités concernent les aspects sensoriels. C'est pourquoi OLEUM, tirant profit de toute la littérature en la matière, a développé et validé deux méthodes chromatographiques à haute résolution (SPME-GC/MS et SPME-GC/FID) destinées aux laboratoires de contrôle officiels, qui seront proposées aux membres du Conseil oléicole international afin qu'elles puissent être adoptées une fois que des limites et des fourchettes seront établies pour les marqueurs les plus pertinents. Ces méthodes instrumentales peuvent être combinées avec le test de dégustation (évaluation sensorielle) en cas de doute sur la classification.
 

En parallèle, les mêmes cibles, c'est-à-dire le nombre minimum de composés volatils considérés comme hautement représentatifs (15-18 composés) ont été utilisées pour proposer des méthodes d’analyse rapides permettant, par exemple, de pré-classer le produit HOVE sur la base de sa qualité sensorielle. Ces méthodes seront particulièrement utiles aux embouteilleurs pour leur permettre de décider rapidement d'acheter ou non un lot d'huile.
 

Le défi d'OLEUM a été également de créer un réseau international, qui rassemble les parties prenantes, afin d’élargir les connaissances sur l'huile d'olive et l'HOVE et de favoriser la compétitivité sur le produit et les méthodes de contrôle. Ce sont des critères d'authenticité et de qualité harmonisés, une culture scientifique solide partagée, qui n'isolent que les fraudeurs, n'alimentent pas les chaînes de promotion négative et les détracteurs du produit, mais visent au contraire à donner en pratique des éléments de certitude supplémentaires.
 

Enfin, je ne m'attarde pas sur les nombreuses directions dans lesquelles le projet s'est dirigé pour rechercher de nouveaux marqueurs et de nouvelles méthodes. Je ne peux que vous conseiller de consulter la page du site web rassemblant tous les articles publiés jusqu'à présent et disponibles en libre accès et je souligne qu'OLEUM s'est également concentré sur une piste potentielle future de proposer, pour la première fois, la validation d'une méthode non-ciblée.
 

Il est également essentiel de mentionner le travail de recherche acharné qui a également abouti à la mise en œuvre de matériaux de référence (MR) : quatre ont été produits et validés. Deux matériaux sensoriels, rance et vineux-vinaigreux, et deux étalons pour les composés volatils à utiliser comme matériel d'étalonnage instrumental. Ils sont tous prêts à être commercialisés. Dans ce cas également, le contrôle de la qualité de l'huile d'olive ouvre la voie à un marché alimentaire plus vaste.
 

En conclusion, et pour tenter de donner une orientation stratégique à l'avenir des contrôles de qualité et d'authenticité de l'huile d'olive, l'UE pourrait emprunter une voie prometteuse : 

1. une stratégie mixte, pour combiner les données sensorielles et instrumentales (une quantification simple des composés volatils spécifiques est désormais abordable !), utile en cas de désaccord entre deux groupes ;
2. une amélioration de la compétence et de l'alignement des tests par étalonnage mutuel, possible dans un avenir proche, si des matériaux de référence (MR) reproductibles sont disponibles sur le marché ;
3. des compositions conformes réelles et virtuelles progressivement mises en œuvre et stockées (pour le virtuel) dans un référentiel de données validées (par exemple la banque de données OLEUM) qui servira de référence d'authenticité
4. des informations de qualité et d'authenticité sur les HO à mettre en relation avec les volumes produits et leur géolocalisation. Les informations relatives à l’intersection entre les contrôles de qualité officiels et la traçabilité, typiques avec la blockchain, pourraient faire partie de la prochaine mesure de lutte contre la fraude.

Tout passe depuis un marqueur unique de qualité et d'authenticité vers une vision globale d'une huile qui pourrait être définie comme "biométrique". Mais nous ne pouvons pas négliger de procéder selon une approche graduelle, simple et robuste, en disséquant progressivement les éléments de complexité pour en faire une nouvelle synthèse efficace, en évitant tout sensationnalisme, qui introduit l'incertitude et l'approximation. C'est le challenge difficile qu'OLEUM a relevé.

The OLEUM final conference

On the 17th and 18th of February 2021, the OLEUM project successfully held its final conference. In total, over 400 people from different fields registered for the online meeting to discover the results of the project and discuss the future possibilities to assure olive oil quality and authenticity.

The event was separated into two days with day one targeted on the outcomes and impacts of OLEUM on the future of Europe’s policies on olive oil and the second day focused on the newly developed analytical tools and methods to further ensure olive oil quality and authenticity.

Prof Giovanni Molari, Head of Agricultural and Food Sciences department at the University of Bologna, welcomed the attendees before project coordinator Prof Dr Tullia Gallina Toschi gave an outline on the most important outcomes of the OLEUM project and stated that the opportunities that arise out of them are of great interest and extremely valuable for the market. The results that the OLEUM project delivers are also taken into account developing future EU olive oil policies.
 

"We need to have a formative role on what is olive oil and what is EVOO." – Prof Dr Tullia Gallina Toschi

The international and continuously growing OLEUM Network gathers and enlarges the high-quality expertise in the analysis and authentication of olive oils. Thus, leading to new and innovative tools and methods to counteract fraudulent activities and protect the quality of olive oil. The findings out of these methods can be stored in the OLEUM Databank which is one of the key outcomes of the project and helps to improve information exchange between different stakeholders of the olive oil community. Due to the many incorrect information around olive oil from various sources, it is an important part of the project to give reliable and science-based information to the public, which is why the communication part of the OLEUM project is of great importance.

The respective methods were introduced and explained by their developers on the second day of the OLEUM final conference. Attendees got an insight into the technical backgrounds and had the possibility to clarify questions from the developers in a Q&A session.
 

The feedback at the end of the conference as well as in the chat and via social media was great and the OLEUM-Team would like to thank all the attendees and speakers to make this possible!
 

For more information on the main outcomes of the project, the recordings of the final conference and other resources, please see the Virtual Package that we prepared for you: Click here

You can find the recording of the final conference here! 

The OLEUM Network

Tassos Koidis, Paul Breton and Enrico Valli
 

Since our last communication, the OLEUM Network is growing steadily both in terms of content and membership. We are now 120 members in our OLEUM Basecamp platform (18% up) and 164 members (21%) in OLEUM ‘Question of the Month’, our LinkedIn network. We have published 3 extra Q&As (Q1: True or False? Heating Olive Oil leads to the production of trans fatty acids. Q2: What is remolido oil? Q3: Is cold pressed EVOO always superior to regular VOO?).  

It was a busy period for some of the OLEUM members conducting the method validation studies that ended just before Christmas. Those members working in private and public testing laboratories, like Jorge from Sovena, found very useful that they could freely access the training material from the two OLEUM workshops that took place in Spain (Oct 19) and Italy (Dec 19) from the Resources of the OLEUM Network. Also, many new students joined the Network lately, like Gabriela from the University of Cordoba, Spain, who wrote: “I needed information about olive oil to prepare my final year MSc project and especially, about the gas chromatography technique for classification of olive oil in the three categories, extra virgin, virgin and lampante. I finished my work in October 2020, but I am currently waiting the evaluation to enter to a PhD programme in the same University”. Since the recent announcement of the OLEUM Final Conference, the Networks in also getting a lot of new attention with daily sign ups. We, the people of the OLEUM project, have a lot of ideas about the future of the OLEUM Network going beyond the official end of the project. But first and foremost, we would love to hear your opinion. Join the Network (for LinkedIn here). If you are interested to hear what was discussed about the next moves of the Network in the OLEUM final conference, please check the conference recording here!

Two sensory reference materials

Prof. Alessandra Bendini, Dr. Diego Luis Garcia Gonzalez, Prof. Tullia Gallina Toschi

In the case of virgin olive oil, sensory assessment is a standard method and, according to International Olive Council (IOC) norms and other national and international regulations (EU Regulations, Codex Alimentarius), its application is mandatory for establishing possible quality grades (e.g. for EU: extra virgin, virgin, lampante) and for marketing the product. 

The laboratories that implement the analytical methods must demonstrate their proficiency in applying testing methods, following the procedures described by EU and IOC, with trials that ensure the validity of the results: this validation process should be carried out with Reference Materials (RMs). In fact, the use of RMs is mentioned as necessary for sensory analysis in current regulations (COI/T.28/Doc.no.1/Rev.4; COI/T.20/Doc. no.14/Rev.5). 

The use of reference materials (RMs) for which definitive numerical values can be associated with different sensory attributes is of absolute necessity to calibrate the measurement process, help assessors in memorization of sensory stimuli, and compare their judgment with “assigned values” and thus improve their individual abilities. For these reasons, the RMs should be applied for continuous monitoring of panels over time as well as for intra-panel and inter-panel control studies. Moreover, the RMs could be very useful also for selection and training of new assessors recruited during numerous courses organized at national and international levels by different organizations and addressed at the specific formation of sensory panellists of virgin olive oils. 

For sensory analysis of VOOs, at present only RMs from natural matrices (authentic olive oils that are used as reference samples of sensory defects provided by IOC, samples from proficiency tests, or certified by at least three accredited sensory panels) are available for training of sensory panels; they are effective in resembling real samples, although they have some limitations in their use over time (e.g. limited availability, difficult to obtain, low homogeneity year by year).

RMs emulating the aromas of winey-vinegary and rancid defects have been formulated at specific dilutions by CSIC, using a collection of synthetic volatile compounds diluted in a flavorless refined olive oil at specific concentrations (Aparicio-Ruiz et al., 2020, Foods, 9(12), 1870), then UNIBO has coordinated their sensory evaluation inside the OLEUM consortium (six panels have been involved) as well as in the context of inter-lab validation just concluded (pre-trial and trial proper phases).

The main outcomes of the inter-lab validation were:

The evaluation of the representativeness of reference materials (RM1 and RM2), in terms of an assessment by the panellists of their ‘usefulness in resembling natural sensory defects of winey-vinegary and rancid’: the data received demonstrated that the RMs were valued as appropriate by a high proportion of end-users. 

The calculation of perceived intensities of the winey-vinegary and rancid defects (RM1 and RM2) because the definition of the intensity of each sensory RM is a fundamental information to permit its possible future use in training of assessors: the alignment among panels respect to the intensity of defect in each RM was reached.

Software to estimate the EVOOs “best before date”

By Maurizio Servili and Tullia Gallina Toschi

The level and the rate of the EVOO quality deterioration are greatly affected by its chemical composition and storage conditions (packaging, temperature, and light exposure), and have been deeply documented to be extremely variable according to those factors. The best before date (BBD) to consume an EVOO to be indicated on label (meaning the minimum storage period within which virgin olive oils retain their chemical and sensory parameters within those corresponding to the declared category) is up to the producer decision and the only other objective information about the age of the oil that can be written (if 100 % of the contents of the container come from that harvest), is the harvesting year (or month). 
 

How can producers provide a reliable BBD for their EVOO, on a scientific basis, since at now they have no objective methods to orient themselves? The availability of a tool to determine the BBD and its preventive use would represent the best tactic of defence against loss of consumer confidence and the risk of fraud allegations.
 

To fill this gap, in the framework of the Oleum project, a software able to predict the BBD of a given EVOO at given storage conditions has been developed and validated.
 

To reach the final goal, prediction models have been built based on a large analytical database produced by following the evolution of selected analytical parameters in a real-time shelf-life experiment on 20 EVOO samples, chosen according to the D-optimal design using the Most Descriptive Compound (MDC) algorithm, in order to cover the experimental domain with oils characterized by low, medium and high concentration combinations of selected fatty acids, hydrophilic phenols and tocopherols.
 

Those 20 EVOO samples were fully analytically characterized for their legal quality parameters, fatty acids profile, antioxidants (hydrophilic phenols and tocopherols), volatile composition, DAGs, and OSI, thus bottled in glass UVA grade, placed on shelves for 12 months to light exposure (for 12 h/day; 25 °C) and for 24 months in the darkness (25-30-35 °C). Sampling and analyses have been carried out monthly for the light exposure and every two months for the darkness.
 

The parameter analysed during real-time shelf-life for the model construction were: acidity, peroxide value, K232, K270, ∆K, hydrophilic phenols, α-tocopherol, volatile compounds and fatty acid composition.
 

The entire data set obtained from the analytical results was used to build two different predictive models, one for the light exposure and one for the dark conditions of storage.
 

Those predictive models were built by a multivariate statistical approach and the coefficients to calculate the missing time for reaching the threshold values of selected legal/quality parameters, in order to determine the BBDs, were extrapolated through the two models.
 

The predictive ability was assessed by internal and external validation, showing a satisfactory accuracy in the prevision of the date where the most important quality and/or legal parameters will be overcome (in terms of K270, the concentration of hydrophilic phenols, threshold of impact volatile compounds for the rancid defect).
 

The software has been developed with a user-friendly interface, so that the inputs to predict the BBD of an EVOO are: sample name, condition of storage (light/dark and temperature), and a selection of analytical parameters. The output is represented by the time for exceeding the threshold value (in months).  The accuracy of the prediction of the BBD is satisfactory for the purpose to provide a tool for the producer needs and for strengthening consumer confidence. 

Standard stock solutions to be used in the analysis of the volatile compounds

Positive and negative sensory attributes in virgin olive oils (VOOs) strictly depend on the composition of the volatile fractions. To date, the organoleptic assessment in VOOs, in terms of the presence and intensity of these sensory attributes, is carried out according to a method known as Panel test. Given the possibility of disagreement in the VOOs classification by different panels, a confirmation/disconfirmation coming from the qualitative and quantitative analysis of specific volatile organic compounds (VOCs) responsible of the defects or the positive attributes, assumes great importance. In this context, the OLEUM project proposed methods for the analysis of volatile compounds in VOOs based on different analytical techniques: from the most consolidated SPME-GC-FID and SPME-GC-MS to the most innovative HS-GC-IMS, this last more adapt for a screening, which can be used for the classification of VOOs in the respective quality grade (extra virgin, virgin and lampante). A qualitative and quantitative instrumental analysis of volatile compounds may be relevant to support the Panel test in addition, once validated signals/markers, to establish limits of concentration of the relevant compounds, describing the off-flavor, for the different quality grades. On the basis of analytical investigations carried out within the OLEUM project, 18 volatile compounds were selected with the aim of having a set with a minimum number of highly diagnostic compounds easily available on the market. They were grouped into two Standard Matrices (SMA and SMB), dissolved in refined olive oil, to drastically reduce the number of analysis for the preparation of calibration curves. The selection of the 18 volatile compounds in SMA or SMB was based: i) on their usual occurrence in VOOs (high or low concentration) and ii) on the need to limit the possible overlaps between compounds, which would otherwise make it difficult to integrate the peaks, thus facilitating the inter-laboratory comparison of the results.
 

The same mixtures can also be used as calibration material to developing rapid screening methods; as recently published in Foods at least 15 of the 18 volatile compounds can be eluted and detected by a HS-GC-IMS. The composition of these matrices has been presented in some public events and is described in detail in another scientific article published in Food Control.

Time domain reflectometry for the detection of blends of EVOOs with tailored soft-deodorized olive oils

Time Domain Reflectometry (TDR) is a well-known technique used in several fields: checking of discontinuities in electric lines, soil moisture determinations, dielectric characterization of food and non-food materials. TDR is based on the response of the matter to an electromagnetic step which takes time to cross and to be reflected, and changes its shape according to the chemical-physical and structural composition of the material. The smaller the sample the faster the electromagnetic step must be. 
 

Extra virgin olive oils (EVOOs) and soft-deodorized olive oils (sdOOs) are chemically different: e.g. they have a different content of Fatty Acid Ethyl Ester (FAEEs). The conventional analytical techniques for determining FAEEs are complex, time-consuming, and reagents requiring. In the Oleum context the possibility of determining the FAEEs content and discriminating among blends of EVOOs and sdOOs was explored by TDR. The used instrumentation was able to generate and acquire the waveform of steps with rising time in the order of some tens of picoseconds and, as a consequence, a probe for few ml of sample could be used. 
 

The shape of reflected signals was analysed by multivariate analysis: Partial Least Squares Regression (PLS) was used to build predictive models of the FAAEs content and PLS Discriminant Analysis (PLS-DA) was applied for discriminating between blends. FAEEs were predicted with a regression characterized by a coefficient of determination (R²) of around 0.81 and with a Root Mean Square Error (RMSE) in the order of a ten of mg/kg. Blends of EVOOs and sdOOs with FAEEs content higher or lower than a selected limit (35 mg/kg) were all correctly classified. Although the results obtained must be corroborated with confirmatory tests considering variables, such as temperature, which can have an influence on the accuracy, the technique seems promising, at least for a screening. 
 

Currently, TDR measurements, such as those here conducted, requires high-cost, multi-functional, generic instrumentation (e.g. an oscilloscope) and personnel skilled in electronic measurements and statistical data analysis; thinking about a market diffusion of an instrumentation for FAEEs determinations, it will certainly be necessary to combine devices and automate calibration procedures and analysis functions in a dedicated and not too expensive tool. The implementation and marketing of such a device, of a cost around three thousand euro, for screening tests could be attractive to companies that manufacture analytical instrumentation.

The OLEUM Databank

Tatyana Dimitrova, Alain Maquet, Viet Mai Hoang, Arantza Respaldiza, Alexander Kerner

An inventory of existing databases on olives and olive oils highlighted the rarity of such systems (e.g. ISAMM system for the conformity checks of olive oils managed by EC) to control the authenticity of this food product. Consultations of stakeholders including national control bodies confirmed the paucity of such databanks reinforcing their interest on a common system, shared among the Member States and based on harmonized analytical methods.

During the project, Oleum Databank was built as an innovative web access platform to store the documents and validated analytical data generated by the OLEUM consortium. This system is developed using only modern and open-source technologies and provides a lot of flexibility. The Oleum Databank could be considered as built by three basic modules - Repository, Database and Search tool with a sophisticated role and access managements.

The repository is dedicated to store documents (in any format like pdf, doc, xls, etc.) with metadata describing each single document like title of the document, author(s), date of creating, date of upload in the repository, short description, purpose, category, status, access policy. The metadata is used in the search option of the repository. The user who uploads the file in the repository decides what access policy should apply to the document. Currently, documents can be stored as Calculation file, Reporting file template, Standard Operating Procedure (SOP), Specification of a reference material, Validation Report. This module supports version control, so each updated document can be traced when referred in an experiment.

The database is structured to manage and trace experiments. In summary, a user builds an experiment selecting participants, which techniques they will use on which samples, the measurands linked to the selected techniques and creates the report template including the metadata of these entities and the measurands to be reported by the participants. The system is quite flexible allowing users to modify, add, set mandatory and optional descriptors for any existing and new entities. The flip coin of this flexibility is a strict control on modifications of metadata to avoid multitude of variants in metadata. This structure aims to allow any users not involved in an experiment to understand, thanks to all the metadata, all details on the objectives, conditions, and results of the experiment(s) of interest. For instance, metadata of a sample describe either a reference sample (information is tracked from the field to bottled oil) or trustful sample (large amount of information is traceable) or experimental sample (available information on a product) including mandatory / voluntary data mentioned in the concerned EC regulations. It is worth to say that in addition to olive oil other edible oils can be registered. Potentially any analytical methods can be handled with appropriate metadata including the methods proposed by the OLEUM project but also those used by Member States to check the conformity of olive oils.

The Search module allows the user to search any keyword in the entire Oleum Databank, in each different entity data categories – documents, samples, sample sets, experiments, results and techniques. It is very powerful and allows the user to explore the available data in the Databank. The results from the search are presented in flexible table which is used for the visualization allowing selecting fields to be visualized, to apply different filters, to size columns, to sort each field, etc. The content of each such table can be exported as a simple csv file and analysed locally to the PC by the user.

In short-term, the Databank will be opened for the public requiring a registration to feed and exploit the database, in order to demonstrate the diagnostic ability of selected analytical methods/measurands to detect adulterated olive oils. In medium-term, depending on the interest of national control bodies, access could be restricted to them for confidentiality reasons.

Rapid fluorescence spectroscopic method

A method to detect the amount of bioactive lipophilic phenolic compounds (tocopherols or vitamin E)

Fresh olive oils contain a variable amount of tocopherols, lipophilic phenolic molecules characterized by antioxidant and vitamin activities (specifically alpha-tocopherol is the form able to play the vitamin E role). 

However, since these compounds are sensitive to oxidation therefore their level declines during oil storage (depending on the adopted conditions and by the natural composition of the oil sample). 

The fluorescent analysis of olive oils takes advantage by the presence of natural fluorescent components (e.g. chlorophylls and derivatives) including tocopherols. 

Fluorescent spectra scan of olive oil samples was performed using an instrument with a 96-wells black plate reader. 

Measurements (excitation at 302 nm and emission at 328 nm) were carried out by transferring directly a little amount of oil sample (250 µl) without any additional treatments (as dilution and extraction, see the Figure 1).

The results of fluorescence analyses of olive oil samples using this tool were found to be in high correlation with the HPLC quantification of alpha-tocopherol content (see Figure 2) and this method was successfully in-house validated (e.g. in terms of parameters as precision, accuracy, LOD, LOQ, robustness).

This approach can permit a rapid, high-throughput screening of the total amount of tocopherols in olive oils samples with almost no sample preparation.

Figure 1: Assay flow diagram - 250 µl of virgin olive oil are transferred into 96-wells plate and subjected to fluorescence spectroscopic analysis.

Figure 2: Correlation between alpha-tocopherol concentrations determined by fluorescence spectroscopic assay and by HPLC-FLD reference method.

Rapid fluorescence spectroscopic method

Portable battery-operated system for determination of free acidity in virgin olive oil

Olive oil quality is affected by different factors such as the extraction process and fruit ripening stage, as well as the storage conditions (light and temperature). A number of parameters (e.g. free acidity, peroxide value), as well as sensory attributes, are assessed to determine the quality of olive oil. Free acidity is the first and most important parameter for oil quality and the official method for its determination is a chemical titration that must be carried out in a laboratory by trained personnel.
 

This project is aimed at the development of a novel technique for the determination of olive oil free acidity that can be easily implemented as a portable electronic system for quick and accurate measurements in-the-field by operators without specific training. This allows even the smaller production centers (oil mills and packaging centers) that cannot afford an internal laboratory for analysis to carry out free acidity measurements in-situ without the costs and time delays associated with the sample shipping to an external laboratory.
 

The measurement working principle is based on Electrical Impedance Spectroscopy (EIS), a technique where a sinusoidal voltage is applied to the sample under test and its electrical characteristics are measured in a range of frequencies. In this case the sample under test is the emulsion between an hydro-alcoholic solution (ethanol 60%, distilled water 40%) and the olive oil sample. Preliminary investigations have been carried out using a commercial impedance analyzer (Agilent E4980A) in the frequency range 20 Hz – 2 MHz. The results have shown that a correlation exists between the oil free acidity and the emulsion electrical conductance measured at low frequencies (< 10 kHz).
 

A portable embedded system for in-situ measurements of olive oil free acidity has been designed and built. The instrument has size 11 x 15 x 5 cm and can be powered by USB port or batteries (3 AAA alkaline batteries 1.5 V). The electronic board, based on the microcontroller STM32L152RCT6A by ST Microelectronics, integrates a LCD screen to output the measurement results, four buttons for user interaction and all the electronics for the electrical measurements (electrical conductance measurements at 200 Hz). The emulsion (15 mL of hydro-alcoholic solution and 1 mL of olive oil) is hosted in a 50 mL Falcon vial modified to feature a couple of stainless steel electrodes (diameter 6 mm, spaced by 12 mm) for the electrical measurements. The instrument has been calibrated and the calibration curve stored in the microcontroller memory. The instrument can perform free acidity measurements in about 30 seconds.
 

After calibration, the system has been in-house validated by carrying out measurements on a set of 30 olive oil samples of different origins with free acidity values between 0.18 and 4.5 (Grossi, M.; Palagano, R.; Bendini, A.; Riccò, B.; Servili, M.; García-González, D. L.; Toschi, T. G.; Design and in-house validation of a portable system for the determination of free acidity in virgin olive oil. Food Control, 2019, 104, 208-216). The accuracy of the system has been evaluated by comparing the instrument output with the results from the official method. A good correlation was found with the official method (R_adj = 0.97) and satisfactory results were obtained in terms of LOD, LOQ, precision and accuracy.

Interlaboratory studies

Paul Brereton (Queen’s University Belfast)

During the final months of the OLEUM activity all the project partners have been all very busy analysing data- lots of data. This is because we are completing one of the world’s largest interlaboratory studies. Actually a set of studies, involving 8 different analytical methods with approximately 15 laboratories for each method, analysing 10 test materials, that is over 1000 pieces of data. Additionally, some methods have two analytes and two of them have 18 (!) which takes it to over 5000 results to analyse!

The methods being studied are:  

    1. Polar phenols analysis used for assessing the olive oil health claim

    2. Free and esterified sterols analysis targeting illegal olive oil blends

    3. Improved methodology for fatty acid ethyl esters targeting illegal processing or lower quality virgin olive oil

    4. A group of methods looking at Sensory and volatiles analyses for quality and authenticity of virgin olive oil  

         a. Analysis of selected volatile compounds in virgin olive oil by gas chromatography

              i. GC-MS

              ii. GC-FID  

         b. Analysis of virgin olive oil volatile fingerprint by SPME-GC-MS and chemometrics, as screening method to support the Panel test

         c. Sensory analysis of virgin olive oils with the use of two Reference Materials  

The above methods range from slight improvements of existing methods, e.g. methods 2 & 3; to new advanced multi-analyte/profiling procedures that aim to complement the official Panel Test (sensory analysis).

Following a pre-trial study conducted in the first half of 2020, most of the main study, the “Trial Proper” took place in the Autumn of 2020. For each of the above methods each participating laboratory was sent a Standard Operating Procedure and a set samples (usually 10 test materials and one practice sample with a known value) to analyse once only. Unbeknown to the participants, the test materials actually comprised 5 sets of duplicate test materials that allow us to calculate within laboratory and between laboratory precision. Following statistics carried out to internationally recognised standards the studied methods can then be assessed for suitability as official methods.

The formalised results will be available soon once we have shared the results with participants and formally closed the study. Some of the procedures will then be proposed as official methods.

We would like to take this opportunity to thank all the laboratories that have taken part in this enormous exercise and have done so in extremely difficult (Covid-19) circumstances.

The OLEUM revolution of quality and authenticity control

From sustainability to big data for compliance

By Tullia Gallina Toschi

The OLEUM project has ended with a final public conference held on February 17th and 18th and is available in videos on the project website. The objectives of the project were pragmatic. OLEUM did not want to extensively investigate the possible quality markers of olive oils regardless of the cost and actual availability of the instruments in the quality control labs. OLEUM wanted to identify new methods applicable in existing conditions or reduce time, solvents and consumables of the methods already legally recognized. The keywords were “renew” or “revise”. Today the importance of the link between the project and the fundamental elements of sustainability is evident. OLEUM's research proposal, sent to the Commission on 26 June 2014, anticipated, for example, some targets of goal 12 of the 2030 agenda, adopted by the UN in September 2015, such as the necessity to reduce release and non-recycling or waste of chemicals (target 12.4) and from this point of view the OLEUM approach can be extended to many other foods.

The other fundamental aspect of the project was the combination of prevention and control. All the stakeholders of the quality of such a precious food as extra virgin olive oil (EVOO) were placed at the same table: small or medium primary producers, who want the oil to be fairly remunerated; large producers or bottlers, who need an additional margin and who must necessarily offer to the market different qualities and prices, but who no longer want to find themselves in conditions of non-compliance and below the legal quality and public control laboratories that must and want to carry out controls with highly diagnostic, robust, rapid, effective and harmonized methods on all territories. Last but not least, the consumer, who must be informed about a product that is widely used but little known in substance, and who wants quality guarantees. Therefore, OLEUM has moved in two directions: developing rapid screening methods useful for prevention and quality control in the companies but developing in parallel and closely relating to highly sensitive and specific methods to be proposed to the standardization tables for adoption in public controls quality.

One of the problems was the sensory quality. It represents one of the three founding pillars of EVOO quality, together with the stringent elements of "freshness" (which can be defined as the quality of the oil at zero time) and the integrity of the starting olives. The technological specificity, being EVOO only pressed, centrifuged and filtered (not refined) product, is an important quality, shared with virgin oil (VOO) which does not have such rigorous determinants of the previous quality. Without flawless sensory quality, EVOO would not exist even though this element remains one of the most difficult to assess. It is well known that most of the non-conformities concern the sensory aspects. For this reason, OLEUM, taking advantage of all the literature on the matter, has developed and validated two high resolution chromatographic methods (SPME-GC/MS and SPME-GC/FID) intended for public control laboratories that will be brought to the table of the International Olive Council so that they can be adopted once limits and ranges will be established for the most relevant markers. These instrumental methods can be combined with the Panel test (sensory evaluation) in case of doubtful classifications.

In parallel, the same levers, i.e. the minimum number of volatile compounds considered highly diagnostic (15-18 compounds) were used to propose rapid screening methods capable, for example, to pre-classifying the EVOO product on the basis of sensory quality. These methods will be especially useful for bottlers to quickly decide whether or not to buy a batch of oil.

The challenge of OLEUM, which has also created an international network, which brings together stakeholders, broadens knowledge about olive oil and EVOO, promotes competitiveness on the product and control methods a positive lever. These are levers of harmonized authenticity and quality, shared robust scientific culture, which isolate only the fraudsters, do not nourish the chains of negative promotion and haters of the product, but instead are aimed at giving in practice further elements of certainty.

Finally, I do not dwell on the many directions in which the project has moved to search for new markers and new methods. I can only refer to the page of the website (http://www.oleumproject.eu/) collecting all the articles published so far and available in open access and I underline that OLEUM has also concentrated in the forward-looking direction of proposing, for the first time, the validation of a non-targeted method.

It is also essential to mention the hard research work that has also come to the implementation of reference materials (RMs): four have been produced and validated. Two sensory materials, rancid and winey-vinegary and two standards for volatile compounds to be used as instrumental calibration material. They are all ready for the market. Also in this case, the quality control of olive oil leads the way for a larger food market.

To conclude and to try to give strategic direction of the future of quality and authenticity controls for olive oil, a promising way that EU could take includes: 

1. A joint strategy, to combine sensory and instrumental data (now an easy quantification of specific volatiles is affordable!), useful in cases of disagreement between two panels;
2. An improvement of the proficiency and alignment of the panels by mutual calibration, possible in the near future, if reproducible reference materials (RMs) will be available on the market;
3. Real and virtual compliant compositions progressively implemented and stored (for the virtual) in a repository of validated data (e.g. OLEUM databank) to be used as authenticity reference;
4. OO quality and authenticity information to be put in relation with volumes produced and their geolocation. The intersection between official quality controls and traceability, typical of a blockchain scenario, could be the next fraud countermeasure.

Everything moves from a single marker of quality and authenticity to an overall vision of an oil that could be defined as "biometric". But we cannot forget to proceed with an incremental, simple and robust approach, gradually distilling elements of complexity to make a new effective synthesis, avoiding any sensationalism, which introduces uncertainty and approximation. This is the difficult challenge that OLEUM has won.

Conferencia final del proyecto OLEUM: ¡No te la pierdas!

El proyecto OLEUM está casi llegando a su final, listo para dar resultados fructíferos. La última conferencia de OLEUM "Mejores soluciones para proteger la calidad y la autenticidad del aceite de oliva", tendrá lugar como un evento online los días 17 y 18 de febrero del 2021 a las 14:00-17:00 CET, así que no os olvides de reservar estas fechas en tu calendario.

El objetivo general del proyecto OLEUM es garantizar de una mejor forma la calidad y la autenticidad del aceite de oliva empoderando la detección y fomentando la prevención del fraude en el aceite de oliva. Durante la conferencia de OLEUM se presentarán los siguientes aspectos principales:

• Los nuevos métodos revisados y validados para el control de la calidad y la autenticidad del aceite de oliva.
• El OLEUM Databank: una herramienta TIC para los controles de conformidad en el sector del aceite de oliva.
• La sostenibilidad de la red OLEUM.

Se abrirá la conferencia con una presentación del desarrollo de las políticas de la UE en conjunto con el seguimiento del método validado por parte del Consejo Internacional del Aceite. Las futuras medidas anti fraude serán críticamente debatidas incluyendo a diferentes stakeholders.

Si estás interesado en el aceite de oliva te invitamos amablemente a unirte a nuestro evento.

El link para registrarse: https://us02web.zoom.us/webinar/register/WN_ltBgGLzrSjG_6ISt_TfoYA

Programa de la conferencia final: http://www.oleumproject.eu/news/article/oleum-final-conference

Para las actualizaciones, sigue a OLEUM en Twitter (https://twitter.com/oleum_eu?lang=en) o visita la web del proyecto OLEUM (http://www.oleumproject.eu/).

Para más información, envía un email a oleum@unibo.it

Método M4C

Análisis sensorial de aceite de oliva virgen con el uso de materiales artificiales de referencia

El método M4C fue desarrollado para mejorar la metodología IOC para la evaluación organoléptica de aceites de oliva virgen mediante el uso de Materiales de Referencia (RM, por sus siglas en inglés) nuevos, artificiales, reproducibles y estables, manufacturados ad hoc para asemejarse al aroma de defectos sensoriales, y para ser usados para la calibración de Paneles Sensoriales (según las indicaciones listadas en la “Guía para la selección, entrenamiento y control de calidad de calificaciones de catadores de aceite de oliva, líderes de panel y entrenadores”). El Procedimiento Operativo Estándar (SOP) para este método estaba enfocado en la recopilación de la retroalimentación sobre la viabilidad del uso de dos Materiales de Referencia como apoyo para la identificación y evaluación de los defectos rancio y avinado en aceites de oliva virgen, así como resaltar problemas eventuales y críticos que puedan ayudar a mejorar los Materiales de Referencia.
 

Los objetivos del ensayo preliminar para el M4C fueron tres:

i) evaluar la representatividad de los materiales de referencia (RM1 y RM2) —por parte de los panelistas— en términos de su utilidad en asemejar el aroma de los defectos sensoriales naturales de avinado-avinagrado y rancio (expresados como valores de porcentaje, siendo posible para cada evaluador una respuesta binaria útil/no útil);

ii) calcular las intensidades percibidas de los defectos avinado-avinagrado y rancio para los materiales de referencia 1 y 2 respectivamente. Esta determinación se llevó a cabo porque la definición de intensidad de cada material de referencia sensorial es una información fundamental para permitir su posible uso futuro en el entrenamiento de evaluadores y control del panel con el tiempo;

iii) evaluar los atributos sensoriales de dos muestras ‘reales’ de aceite de oliva virgen, con el fin de usarlas como muestras caracterizadas sensorialmente (muestras de entrenamiento), en la sucesiva validación formal. En la misma, estas dos muestras caracterizadas serán presentadas a los evaluadores para ser re-analizadas, usando en paralelo los dos materiales de referencia, para establecer si la provisión de estándares específicos de referencia para avinado y rancio pueden facilitar el reconocimiento de estos atributos en muestras y cuantificar sus intensidades.

Diez laboratorios privados/públicos, que tenían un panel sensorial entrenado para el análisis de aceite de oliva y reconocido por organismos de control nacionales/internacionales, participaron en el ensayo preliminar. El grupo estaba compuesto por 3 integrantes de Italia, 3 de España, 2 de Alemania, 1 de los Estados Unidos y 1 de Australia. Los participantes recibieron dos muestras diferentes de aceite de oliva virgen y los dos materiales de referencia. Se les pidió que las analizaran siguiendo el procedimiento operativo estándar preparado por los desarrolladores del método. Los participantes también tuvieron la oportunidad de asistir a un taller de transferencia de conocimiento, en diciembre de 2019, en Bolonia. En dicho taller formularon preguntas y proporcionaron retroalimentación acerca de la aplicación del protocolo analítico y la información del procedimiento operativo estándar en particular. Los laboratorios participantes no reportaron problemas o dificultades relacionadas con el procedimiento operativo estándar; por consiguiente, no se realizaron cambios en este documento.

El alto número de respuestas positivas relacionadas con la representatividad de los materiales de referencia sugirió un acuerdo en la similitud con los aromas naturales, cuando estos materiales de referencia fueron presentados a paneles diversos. Sin embargo, considerando los comentarios recibidos por los laboratorios participantes para el análisis de materiales de referencia, así como los resultados obtenidos relacionados con los valores medios de intensidades, UNIBO y CSIC decidieron seleccionar y preparar para el ensayo correcto mezclas de materiales de referencia —más diluidos que los que fueron distribuidos durante el ensayo preliminar— para ser evaluadas (solo vía olfatoria).

Por el Alma Mater Studiorum – Universidad de Bolonia (UNIBO): Prof. Alessandra Bendini

Por el Instituto de la Grasa (CSIC): Dr. Diego Luis García González

Método M4B

Planteamiento no específico para el análisis de la huella volátil de aceite de oliva virgen por SPME-GC-MS y quimiometría

El método describe una estrategia de evaluación que cumple los los requerimientos para discriminar aceites de oliva virgen entre los grados de calidad ‘Virgen Extra’, ‘Virgen’ o ‘Lampante’. Tiene como fin apoyar los paneles sensoriales, reduciendo su carga de trabajo y, por tanto, mejorando su desempeño¹. Está basado en un modelo de clasificación jerárquica construido con la huella volátil de muestras de aceite de oliva virgen obtenida  por micro-extracción en fase sólida (SPME) y posterior separación de analitos por cromatografía de gases con detector de espectrometría de masas (MS).

Aún no hay consenso sobre el proceso para validar métodos analíticos de huellas como el presente; tampoco se han fijado lineamientos precisos². Por tanto, realizamos un estudio de validación de pares que se enfoca en evaluar la señal en bruto proporcionada por los participantes, entendiendo la variabilidad y las fuentes de error que ayudarán a construir un modelo sólido de clasificación en el futuro. La principal limitación del método analítico de huellas está en proporcionar una señal cromatográfica repetible y reproducible con suficiente sensibilidad para recolectar información valiosa de las muestras; así, la repetibilidad intra- e inter-laboratorios es evaluada para los 4 participantes.

Primero, la repetibilidad intra-diaria de cada participante fue evaluada calculando la Desviación Típica Relativa (RSD) en cada punto de datos —excluyendo el ruido— del cromatograma total de iones (TIC, por sus siglas en inglés). Todos los participantes lograron una RSD<20 % en más del 95 % de las señales. Además, al trazarlas, se observó una relación inversa entre los valores de la RSD% y la intensidad, coincidiendo con la ecuación de Horwitz³.

Luego, la reproducibilidad inter-laboratorio fue revisada mediante análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en inglés), después de la normalización de la señal y la alineación, para resolver el cambio de tiempo de retención típico de los datos cromatográficos. El PCA mostró una agrupación satisfactoria de cada muestra del ensayo preliminar, indicando un resultado analítico preciso (Figura 1). Además, el grupo de control de calidad (QC) combinado está ubicado cerca del control de calidad previamente analizado por los desarrolladores, indicando una reproducibilidad satisfactoria. La cercanía del grupo de control de calidad combinado a las muestras de Virgen Extra y Lampante —utilizadas para preparar el control de calidad combinado— sugiere un peso mayor de las variables relacionadas con estos perfiles sensoriales.

Bajo este ámbito, los resultados obtenidos en el ensayo preliminar fueron prometedores; el tipo y alcance de la variabilidad entre las señales han sido evaluados y algunas fuentes de error identificadas. El número limitado de participantes y de muestras dificultó el potencial para capturar mejor la variabilidad instrumental y analítica.

1. B. Quintanilla-Casas, et al. Virgin Olive Oil Volatile Fingerprint and Chemometrics: Towards an Instrumental Screening Tool to Grade the Sensory Quality. LWT - Food Science and Technology 2020, 121, 108936.

2. J. Riedl, S. Esslinger, C. Fauhl-Hassek. Review of validation and reporting of non-targeted fingerprinting approaches for food authentication. Analytica Chimica Acta (2015) 885:17-32.

3. Horwitz, W. Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Foods and Drugs. Analytical Chemistry 1982, 54, 67–76.

Figura 1. Análisis de componentes principales (PCA) en intensidades relativas del cromatograma total de iones (normalizado, no escalado) de: muestras del ensayo preliminar analizadas por los participantes (10, OLPT_M4b_010 combinados QC; 11, OLPT_M4b_011 - Aceite Lampante; muestras analizadas por el laboratorio de referencia durante la validación interna (QC_VAL, combinada QC; EV_RSs, Muestras de Referencia de Virgen Extra, L_RSs, Muestras de Referencia de Lampante).

Nota: Características PCA: 2PC, 89,4% de varianza explicada.

Por el equipo de desarrollo de la Universidad de Barcelona: Stefania Vichi y Alba Tres

Método M4A

Planteamiento específico para la determinación de compuestos volátiles en aceite de oliva virgen utilizando cromatografía de gases

El método M4A fue desarrollado para determinar el contenido de 18 compuestos volátiles seleccionados en aceites de oliva virgen, los cuales son responsables del aroma y los defectos sensoriales. La determinación está basada en el aislamiento y pre-concentración de volátiles por micro-extracción en fase sólida (SPME, por sus siglas en inglés) y la posterior separación de analitos por cromatografía de gases.

El Procedimiento Operativo Estándar (SOP) para este método estaba enfocado en la descripción y estandarización de un protocolo analítico para la determinación de la composición volátil del aceite de oliva virgen, con el objetivo final de mejorar la metodología IOC para la evaluación organoléptica y clasificación de aceites de oliva virgen, apoyando y complementando la función de las pruebas de cata. Dos métodos fueron proporcionados dependiendo del detector utilizado para la cuantificación: detector de ionización de llama (FID, por sus siglas en inglés) y espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés). Como da a entender el uso de SPME, el método determina los compuestos volátiles en los espacios de cabeza del aceite de oliva virgen, aunque podría aplicarse a otros tipos de aceites de oliva.

Los objetivos del ensayo preliminar para el M4A fueron:

1. Cuantificar la concentración de los 18 compuestos volátiles seleccionados en dos muestras reales de aceite de oliva, utilizando una calibración por medio de dos matrices estándar previamente preparadas que contienen una concentración conocida de tales volátiles.
2. Comparar los resultados del estudio de validación inter-laboratorio dentro del consorcio OLEUM con los resultados obtenidos por laboratorios fuera del mismo, observando los valores de la desviación típica relativa (RSD, por sus siglas en inglés) para cada compuesto volátil informado por los diferentes laboratorios participantes.

Siete laboratorios públicos/privados participaron en el ensayo preliminar. Fueron 2 de China, 2 de España, 1 de Italia, 1 de los Estados Unidos y 1 de Portugal. Los participantes recibieron 4 materiales de prueba (dos muestras de aceite de oliva virgen y dos matrices estándar para la calibración) y se les pidió que los analizaran siguiendo el procedimiento operativo estándar preparado por los desarrolladores del método. Este método fue presentado en un taller técnico, en diciembre de 2019, en Bolonia, con el objetivo de tener una comunicación directa con usuarios finales (profesionales del análisis de aceite de oliva virgen) y responder preguntas y dudas, discutir propuestas de mejora y recibir retroalimentación general sobre su aplicación práctica y utilidad en el control de calidad del aceite de oliva virgen.

El estudio está siendo llevado a cabo de forma separada con dos tipos de detectores, FID y MS, para tener información sobre el desempeño de los métodos con estas dos posibilidades. La RSD% para cada uno de los compuestos volátiles fue similar al valor de la RSD% obtenida de la validación inter-laboratorio de OLEUM antes del ensayo preliminar. Las fuentes de errores (calibración, identificación, etc.) también fueron analizadas e identificadas. Las revisiones sobre el procedimiento operativo estándar como consecuencia del ensayo preliminar consistieron mayormente en presentar información con una mayor claridad en las explicaciones y detalles.  El uso de un archivo Excel combinado para todos los cálculos durante este estudio fue revelado como una herramienta crítica para conseguir datos homogéneos.

Por el Instituto de la Grasa (CSIC): Clemente Ortiz-Romero, Diego L. García-González.

Por el Alma Mater Studiorum – Universidad de Bolonia (UNIBO): Enrico Casadei, Enrico Valli.

Método M3

Determinación de ésteres etílicos de ácidos grasos en aceites de oliva virgen por SPE-GC-FID
 

El método M3 fue desarrollado como parte de las “Soluciones analíticas que abarcan problemas de autenticación del aceite de oliva” englobadas en el WP4, específicamente dentro de la Tarea 4.2 “Detección de procesamiento ilegal (desodorización): marcadores y herramientas analíticas”. El procedimiento permite el aislamiento de la fracción que contiene los ésteres etílicos de los ácidos grasos (FAEE) presentes en muestras de aceite de oliva virgen. Este método usa extracción en fase sólida (SPE) en cartucho de gel de sílice de 1 g para el aislamiento del analito como alternativa rápida a la fase preparatoria definida por el Anexo XX del Reg. EEC 2568/91 para determinación de FAEE, que requiere un alto volumen de disolventes y un procedimiento muy largo y complejo. La fracción aislada es analizada posteriormente por GC-FID, utilizando inyección on-column y una columna de baja polaridad.
 

Nuestro interés en esta determinación reside en el hecho de que la evaluación analítica del contenido de FAEE es uno de los parámetros que permite definir el grado de calidad de un aceite de oliva, y detectar mezclas fraudulentas de aceites de oliva virgen extra con aceites de menor calidad, sean virgen, lampante o, de forma indirecta, algún tipo de aceite desodorizado suavemente.
 

El esquema del método M3 se muestra en la Fig. 1. El método ha sido validado internamente en términos de precisión, recuperación, linealidad, robustez, límite de detección (LOD), y límite de cuantificación (LOQ).

Fig. 1 Esquema del aislamiento de la fracción de FAEE mediante SPE

La determinación del grado de concordancia entre los resultados obtenidos aplicando el método propuesto y aquellos obtenidos con el procedimiento de referencia (Anexo XX del Reg. EEC 2568/91 para la determinación de FAEE) demostró la equivalencia de los mismos.

De acuerdo con los procedimientos del proyecto OLEUM, el método M3 fue seleccionado para su validación completa, lo que incluía la participación de diez laboratorios en un estudio preliminar, donde los participantes recibieron dos muestras diferentes de aceite de oliva virgen extra para analizarlas siguiendo el procedimiento operativo estándar (SOP) preparado por los desarrolladores del método. Los participantes también tuvieron la oportunidad de asistir a un taller de transferencia de conocimiento en Sevilla (octubre de 2019), en el cual hicieron preguntas y proporcionaron retroalimentación sobre la aplicación del SOP.

Los puntos débiles que surgieron en el estudio preliminar fueron abordados en la versión revisada del SOP enviado a los diecisiete participantes del ensayo de validación fomal, cuyos resultados están siendo recogidos actualmente.

Instituto de la Grasa -CSIC- equipo de desarrollo M3: Raquel B. Gómez-Coca, Mª del Carmen Pérez-Camino y Wenceslao Moreda

Método M2

Método SPE/GC-FID para detectar esteroles libres y esterificados
 

Los aceites de oliva son uno de los componentes importantes de la dieta mediterránea. Por esa razón pueden ser productos bastante costosos donde es frecuente el fraude. Por ejemplo, el aceite de oliva virgen extra suele ser diluido con otros aceites de oliva de menor calidad o con aceites vegetales baratos, como aceites de semillas. En este contexto, la evaluación analítica de la composición de esteroles es una herramienta consolidada para valorar la pureza de los aceites de oliva, ya que dependen del origen botánico de los mismos. Los métodos que están disponibles (ISO 12228, COI/T.20/Doc. No. 10, Reg. (CEE) 2568/1991, Todos. V) son adecuados para determinar la composición total de esteroles independientemente de si están en forma libre o esterificada. En diferentes aceites vegetales, los esteroles pueden estar distribuidos de manera distintas entre estas dos formas. 
 

Por esta razón se ha propuesto un método analítico nuevo para la determinación de componentes menores libres y esterificados (ceras, ésteres alquílicos, alcoholes grasos libres, esteroles libres y esterificados, alcoholes triterpénicos libres y esterificados, esterenos, y tocoferoles libres y esterificados) en aceites de oliva y de semilla. La metodología, que está enfocada no solo en la detección de esteroles libres y esterificados, sino también en algunos alcoholes triterpénicos característicos, podría ser utilizada como herramienta de evaluación para detectar adulteración con aceites de semilla.
 

El procedimiento es muy simple, rápido y no requiere instrumentos caros y/o complejos. Consiste en una derivatización directa de los esteroles libres en las muestras de aceite, que son convertidos en derivados de sililo. De este modo su polaridad pasa a ser la misma que la de los esteroles esterificados. La muestra de aceite es fraccionada mediante extracción en fase sólida para la remoción de triacilgliceroles y otras interferencias de la matriz, y la fracción que contiene los esteroles libres y esterificados es analizada por GC en columna capilar. El método tiene el potencial de detectar mezclas ilegales de aceite de oliva y otros aceites vegetales, estando los resultados expresados en porcentajes o concentración absoluta de las formas libre y esterificada. Sin embargo, hay que destacar que el método aquí propuesto no tiene la intención de remplazar al método de esteroles totales (ISO 12228, COI/T.20/Doc. No. 10), ya que ambos proporcionan diferentes tipos de información. Los dos métodos podrían ser complementarios y utilizados en conjunto para obtener un mayor grado de información acerca de la naturaleza de la muestra de aceite y, por tanto, reforzar los métodos analíticos disponibles para la prevención de fraude.

El procedimiento analítico ha sido validado internamente con precisión intra-laboratorio satisfactoria (RSD entre 3 y  6 %). Seguidamente se llevó a cabo la primera parte de un estudio de validación. Para este propósito diez laboratorios europeos, que recibieron dos tipos diferentes de muestras de aceite de oliva, hicieron parte del estudio preliminar. Los participantes recibieron un Procedimiento Operativo Estándar (SOP) e instrucciones para la preparación y almacenaje de las muestras. La precisión intra-laboratorio fue peor que la observada durante la validación interna. Sin embargo, muchas de las causas de estos resultados anómalos han sido identificadas y se han tomado medidas correctivas para la validación formal. También se ha recibido retroalimentación sobre el SOP por parte de los participantes, lo cual ha servido para evaluar mejor si los laboratorios que están enviando resultados están siguiendo correctamente el mismo.
 

El ensayo preliminar identificó exitosamente las causas de los resultados anómalos y permitió varias mejoras. Se espera que los datos de desempeño del método en la validación formal, que debe comenzar en septiembre de 2020, sean satisfactorios.

Por la Universidad de Udine: Paolo Lucci

Método M1

Determinación del contenido total de hidroxitirosol y tirosol en el aceite de oliva, desde el punto de vista de sus beneficios saludables, mediante UHPLC
 

El método M1 fue desarrollado dentro de la tarea “Aumentando la confianza del consumidor en las propiedades saludables del aceite de oliva virgen extra: desarrollo de métodos para determinar los compuestos fenólicos” en determinación mediante UHPLC del contenido total de hidroxitirosol (Htyr) y tirosol (Tyr) en el aceite de oliva, desde el punto de vista de sus propiedades saludables, presentado por la regulación EC 432/2012 para “polifenoles de aceite de oliva”. Este método tiene como objetivo cuantificar el contenido total de Htyr y Tyr en la fracción polar del aceite de oliva, seguido de la hidrólisis ácida de sus formas ligadas. Este contenido puede cuantificarse de forma precisa utilizando estándares disponibles comercialmente, y es expresado como Htyr total y Tyr (mg/20 g de aceite) después de la corrección de las diferencias de peso molecular entre las formas libres y ligadas. La UHPLC ha sido utilizada para acelerar el análisis (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(6), 1044; https://doi.org/10.3390/molecules24061044).
 

El método M1, que está gráficamente representado en la Fig. 1, ha sido validado internamente en términos de especificidad, linealidad, precisión, recuperación y robustez, incluyendo la determinación de los LOD y LOQ de los analitos. El procedimiento de extracción no fue validado, como lo fue el propuesto por IOC (COI/T.20/Doc. No. 29, 2009) sin la adición del estándar interno.
 

Fig. 1 Protocolo UHPLC validado internamente según el propósito de beneficios para la salud de Htyr y Tyr en aceite de oliva

Los resultados del método M1 han sido comparados con los obtenidos según el método COI (Method COI/T.20/DOC. 29/Rev. 1 – 2017, Determinación de biofenoles en aceite de oliva por HPLC) como se mostró en una publicación reciente (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(13), 2429; https://doi.org/10.3390/molecules24132429).

De acuerdo con procedimientos del proyecto OLEUM, el método M1 fue seleccionado para validación total, que es llevada a cabo en dos ciclos. Trece laboratorios de Europa, China, Estados Unidos y Australia participaron entre septiembre y diciembre de 2019 en el estudio preliminar. Los participantes recibieron dos muestras diferentes de aceite de oliva virgen extra para analizarlas según el procedimiento operativo estándar (SOP, por sus siglas en inglés) preparado por los desarrolladores del método. Los participantes también tuvieron la oportunidad de asistir a un taller de transferencia de conocimiento, en octubre de 2019, en Sevilla, en el cual hicieron preguntas y proporcionaron retroalimentación sobre la aplicación del protocolo analítico y la información del procedimiento operativo estándar en particular.

El análisis de meta datos de los cromatogramas y los respectivos resultados cuantitativos identificaron la etapa de la hidrólisis como crítica si no se seguían las condiciones exactas descritas en el procedimiento operativo estándar.  Los puntos débiles que surgieron en el estudio preliminar fueron abordados en la versión revisada del procedimiento operativo estándar enviado a los participantes del ensayo. Además, un audio-video del método M1 que incluye explicaciones sobre cálculos con ejemplos, que también fue producido por los desarrolladores, está disponible en YouTube (https://www.youtube.com/watch?v=-nr45PnLnF4) a través de OLEUM, para facilitar el entrenamiento de los interesados. La validación formal del método se está llevando a cabo en la actualidad.

Por el equipo de desarrolladores M1 de la Universidad Aristóteles

Maria Z Tsimidou (Profesora) y Nikolaos Nenadis (Profesor Asistente)

Introducción al sexto boletín de OLEUM

OLEUM: actualización sobre nuevos métodos y materiales para abordar la calidad y autenticidad del aceite de oliva

Por Tullia Gallina Toschi y Paul Brereton
 

El mundo del aceite de oliva (AO) enfrenta a diario problemas relacionados con su calidad y autenticidad. El aceite de oliva, y particularmente el aceite de oliva virgen extra (AOVE), es un producto de calidad superior en términos nutricionales. En el caso del AOVE, éste tiene atributos sensoriales. Dicho aceite tiene un valor de mercado entre un 15 y un 10 % superior al del aceite de oliva virgen (AOV), de una categoría menor. Este valor se debe principalmente a sus atributos sensoriales. Así “EXTRA” haría referencia a la ausencia de cualquier defecto sensorial, y es aquí donde radica el interés de los estafadores. Esto se confirma por el hecho de que la mayoría de no conformidades registradas en Europa tienen que ver con calidad sensorial. Entonces, ¿qué hacer?. El propósito de OLEUM es desarrollar y validar métodos que puedan ayudar en la evaluación sensorial (Panel de Cata). De esta manera se protege al consumidor de afirmaciones falsas hechas en la etiqueta de la botella.
 

Dado que los mayores desacuerdos en las clasificaciones sensoriales se encuentran en los llamados AOVE “límites”, es muy útil tener métodos instrumentales para identificar y cuantificar compuestos volátiles claves que contribuyan al análisis sensorial. Uno de los métodos propuestos para la validación es el procedimiento SPME-GC / MS o SPME-GC / FID (Método 4A). Este método dirigido (mide compuestos específicos) se propuso para ser usado como prueba complementaria en caso de desacuerdo entre paneles (Fig. 1). Con el tiempo podría ser usado también como medida de control de calidad, para “anticipar” los resultados del panel de cata. Antes de que el método sea apto para su uso, es necesario verificar los parámetros de desempeño del mismo, incluyendo la reproducibilidad en la cuantificación de los compuestos volátiles específicos. Esto permitirá la compilación de límites y rangos fiables para los diferentes grados de aceite de oliva virgen, que podrían ser presentados al Consejo Oleícola Internacional (COI) para su aprobación.
 

Además, OLEUM también se propone llevar a cabo uno de los primeros estudios destinados a desarrollar y validar un método no dirigido, donde el enfoque está en obtener y comparar el perfil de compuestos volátiles (Método 4B). Desde hace pocos años muchos fabricantes de instrumentos se han propuesto autenticar productos alimenticios utilizando métodos rápidos no dirigidos (NTMs, por sus siglas en inglés), pero su implementación ha sido obstaculizada por la falta de un proceso de validación formal. OLEUM está contribuyendo a esta nueva área, produciendo materiales de referencia y llevando a cabo estudios de comparación inter-laboratorios acerca de métodos rápidos no dirigidos.  De esta manera podremos comparar el desempeño de ambos tipos de métodos, dirigidos y no dirigidos, para evaluar compuestos volátiles, llevando los métodos rápidos no dirigidos un paso más cerca de su implementación.
 

Finalmente, otros tres métodos están siendo validados dentro de OLEUM: el primero (Método 1) mide polifenoles a la luz de sus propiedades saludables (Reg. EU 432/2012). El segundo (Método 2) mide esteroles libres y esterificados de manera que proporciona información adicional útil para la autenticidad y detección de la adición de otros aceites vegetales. El tercer método (Método 3), que está siendo sometido a validación, es la revisión del método oficial para la determinación de ésteres etílicos de ácidos grasos (FAEE, por sus siglas en inglés), usando un proceso mejorado y más rápido de Extracción en Fase Sólida (SPE, por sus siglas en inglés), en lugar del procedimiento tradicional actual de cromatografía en columna.
 

El último reto es la obtención de materiales de referencia reconocidos, validados y reproducibles internacionalmente, particularmente los destinados al análisis sensorial. OLEUM está llevando a cabo un ejercicio de validación, evaluando la intensidad y utilidad de materiales de referencia para el reconocimiento del defecto avinado-avinagrado y para el rancio (Método 4C).

Fig. 1 Uso posible de un abordaje instrumental dirigido como herramienta de confirmación / ausencia de confirmación de la evaluación sensorial (Panel de Cata).

Conferenza finale del progetto OLEUM: le date da memorizzare!

OLEUM sta volgendo al termine. I risultati ottenuti verranno presentati nell’ambito della conferenza finale di progetto che si terrà online su Zoom nei giorni 17 e 18 febbraio 2021 (h. 14.00-17.00 CET).

OLEUM ha l’obiettivo di mettere a punto o revisionare e validare metodi analitici innovativi per assicurare la qualità e l’autenticità dell’olio di oliva e per individuare e prevenire le frodi.

Durante la conferenza finale saranno presentati i principali risultati del progetto:

• i metodi analitici, i marcatori e gli standard validati utili per il controllo della qualità e dell’autenticità dell’olio di oliva;
• la banca dati OLEUM (OLEUM Databank) – una piattaforma di supporto ai controlli di conformità nel settore dell’olio di oliva contenente procedure, dati e informazioni relative alla calibrazione ed alla validazione dei metodi;
• la composizione e l’attività dell’OLEUM Network.

La conferenza finale è rivolta a tutti/e coloro che, a vario titolo, sono interessati alla tutela della qualità e dell’autenticità dell’olio dell’oliva.

Il link per la registrazione gratuita:

https://us02web.zoom.us/webinar/register/WN_ltBgGLzrSjG_6ISt_TfoYA

Programma della conferenza finale: http://www.oleumproject.eu/news/article/oleum-final-conference

Nel frattempo, si può seguire OLEUM su Twitter (https://twitter.com/oleum_eu?lang=en) o visitando il sito web di progetto (http://www.oleumproject.eu/).

Per eventuali informazioni, è possibile scrivere all’indirizzo mail oleum@unibo.it

Metodo M4C

Analisi sensoriale dell'olio di oliva vergine con l'uso di materiali di riferimento artificiali

Il metodo M4C è stato sviluppato come ausilio alla metodologia del COI (Consiglio Oleicolo Internazionale) per la valutazione organolettica degli oli di oliva vergini (VOO); infatti, si sono proposti nuovi materiali di riferimento (RM), artificiali, riproducibili e stabili, formulati ad hoc per assomigliare all'aroma di specifici difetti sensoriali, da usare per l’allenamento e calibrazione dei giudici che operano nei panel sensoriali (in ottemperanza alle indicazioni riportate nella "Guida per la selezione, la formazione e il controllo di qualità degli assaggiatori di olio di oliva vergine - qualificazioni degli assaggiatori, dei capi panel e dei formatori").
 

La procedura operativa standard (SOP) è stata predisposta con la finalità di raccogliere le opinioni dei panel sensoriali sull’utilità di due RM da usarsi come supporto nell'identificazione e valutazione dei difetti di avvinato-inacetito e di rancido in oli di oliva vergini, dando la possibilità ai giudici di evidenziarne eventuali criticità.
 

Gli obiettivi del pre-trial per l'M4C erano:

i) valutare la rappresentatività dei due materiali di riferimento (RM1 e RM2) in termini di loro utilità in quanto rassomiglianti all'aroma dei difetti di avvinato-inacetito e di rancido (espressa in valore percentuale, con la possibilità per ogni giudice di indicare una risposta binaria cioè utile/non utile);

ii) calcolare le intensità percepite dei due difetti per RM1 e RM2; questa determinazione è necessaria poiché l'intensità di ogni RM sensoriale è un'informazione fondamentale per permetterne il possibile utilizzo nelle fasi di selezione, formazione ed allenamento dei giudici e nel controllo della performance del panel nel tempo;

iii) caratterizzare sensorialmente due campioni di olio di oliva vergine applicando la metodologia ufficiale (scheda e foglio di calcolo) per utilizzarli successivamente nei trial proper come campioni di riferimento per un test di confronto contenente i due RM.

Al pre-trial hanno partecipato dieci laboratori pubblici/privati, dotati di un panel sensoriale per l'analisi dell'olio d'oliva riconosciuti da organismi di controllo nazionali/internazionali, nello specifico: 3 dall’Italia, 3 dalla Spagna, 2 dalla Germania, 1 dagli Stati Uniti e 1 dall’Australia. I partecipanti hanno ricevuto due diversi oli di oliva vergini e i due RM e sono stati invitati ad analizzare questi campioni secondo una procedura operativa standard (SOP) preparata dagli sviluppatori del metodo. Tali panel hanno anche avuto l'opportunità di partecipare ad un workshop dedicato svoltosi nella prima metà di dicembre 2019 a Bologna. Nel corso di questo workshop i partecipanti hanno avuto la possibilità di porre domande e richiedere chiarimenti su specifici aspetti del protocollo analitico. A tale proposito, non sono stati segnalati particolari problemi o difficoltà relativi alla SOP e, conseguentemente, non è stato necessario apportate significative modifiche a tale documento.

L'elevato numero di risposte positive sulla rappresentatività dei due RM ha messo in luce un soddisfacente livello di somiglianza con i relativi difetti naturali. Inoltre, i commenti ricevuti dai laboratori partecipanti e i risultati ottenuti relativi ai valori della mediana delle intensità, hanno suggerito agli sviluppatori (UNIBO e CSIC) di preparare i due RM in forma più diluita per la successiva analisi in fase di trial proper.

La fase di validazione piena (trial proper) si è svolta nell’autunno del 2020.

Per l'Alma Mater Studiorum - Università di Bologna (UNIBO): Prof. Alessandra Bendini

Per l'Instituto de la Grasa (CSIC): Dr. Diego Luis García González

Metodo M4B

Metodo di screening per la determinazione della categoria merceologica degli oli di oliva vergini mediante analisi untargeted SPME-GC-MS del profilo in composti volatili

Il metodo descrive una strategia di screening finalizzata alla discriminazione degli oli di oliva vergini (VOO) nelle categorie merceologiche "Extra vergine", "Vergine" o "Lampante", con l'obiettivo di sostenere i panel, riducendone il carico di lavoro anche per potersi focalizzarsi su campioni borderline e migliorando, di conseguenza, le prestazioni. Si basa su un modello di classificazione gerarchica realizzato mediante fingerprint volatile dei campioni di VOO,  ottenuto attraverso micro estrazione in fase solida (SPME) e successiva separazione degli analiti con gascromatografia accoppiata ad un rivelatore a spettrometria di massa (MS).

Ad oggi mancano ancora un consenso ed un approccio condiviso sulla procedura di validazione dei metodi fingerprintcosi come le linee guida precise². A tal proposito è stato effettuato, nell’ambito di OLEUM, un primo studio di validazione tra più laboratori .   nel quale sono stati valutati i segnali analitici grezzi forniti dai partecipanti, allo scopo di comprendere la variabilità e le possibili fonti di errore utili alla realizzazione futura di un modello di classificazione robusto. L’obbiettivo principale del metodo analitico di fingerprint consiste nel fornire  risultati cromatografici ripetibili, riproducibili e con una buona sensibilità, così da poter valutare la ripetibilità intra ed inter-laboratorio.

In primo luogo, la ripetibilità intra-giornaliera di ogni laboratorio partecipante è stata valutata calcolando la deviazione standard relativa (RSD) di ogni punto del segnale, escluso il rumore, relativo al cromatogramma (TIC - Total Ion Chromatogram). Tutti i partecipanti hanno ottenuto una RSD con valori inferiori al 20% per il 95% dei segnali ottenuti .Inoltre, durante il trial è stata osservata una relazione inversa tra i valori RSD% e l'intensità del segnale, in accordo  al’equazione di Horwitz³.

La riproducibilità inter-laboratorio è stata verificata mediante l'analisi delle componenti principali (PCA - Principal Component Analysis), dopo la normalizzazione e l'allineamento del segnale per risolvere il problema relativo allo spostamento dei tempi di ritenzione. La PCA ha mostrato un cluster soddisfacente perogni campione del pre-trial, (Figura 1).Inoltre, anche il cluster riguardante il campione in analisi come controllo  qualità dell’analisi (QC - quality control) si trova vicino al QC analizzato dagli sviluppatori in precedenza, indicando in questo modo una riproducibilità soddisfacente. La vicinanza tra il  cluster del campione controllo qualità con i campioni Extravergine e Lampante, entrambi impiegati per prepararlo,  suggerisce un contributo maggiore dei relativi profili volatili nella definizione di quello del controllo qualità.

I risultati ottenuti nel pre-trial sono stati promettenti e hanno consentito di valutare il tipo e l’entità della variabilità tra i segnali ed alcune fonti di errore; nonostante questo, il numero ridotto di partecipanti e di campioni ha rappresentato un limite per la valutazione della variabilità strumentale e analitica.

La fase di validazione piena (trial proper) si è svolta nell’autunno del 2020.

1. B. Quintanilla-Casas, et al. Virgin Olive Oil Volatile Fingerprint and Chemometrics: Towards an Instrumental Screening Tool to Grade the Sensory Quality. LWT - Food Science and Technology 2020, 121, 108936.

2. J. Riedl, S. Esslinger, C. Fauhl-Hassek. Review of validation and reporting of non-targeted fingerprinting approaches for food authentication. Analytica Chimica Acta (2015) 885:17-32.

3. Horwitz, W. Review of validation and reporting of non-targeted fingerprinting approaches for food authentication. Analytical Chemistry 1982, 54, 67-76.

Figura 1: Analisi delle componenti principali (PCA) sulle intensità relative TIC (normalizzate, non in scala) di: campioni analizzati dai partecipanti durante il pre-trial (10, OLPT_M4b_010 QC raggruppato; 11, OLPT_M4b_011- olio lampante); campioni analizzati dal laboratorio di riferimento durante la validazione interna (QC_VAL, QC raggruppato; EV_RS, campioni di riferimento extra vergine; L_RSs, campioni di riferimento lampante).

Nota: caratteristiche PCA: 2PC, 89,4% della varianza spiegata.

Per il team di sviluppo dell'Università di Barcellona: Stefania Vichi e Alba Tres

Metodo M4A

Metodo targeted per la determinazione dei composti volatili nell'olio di oliva vergine mediante gascromatografia

Il metodo M4A è stato sviluppato per la determinazione quali e quantitativa negli oli di oliva vergini (VOO) di 18 composti volatili selezionati, riconducibili al fruttato e ai difetti sensoriali. La determinazione si basa sull'isolamento e sulla pre-concentrazione dei composti volatili mediante micro estrazione in fase solida (SPME) e  successiva separazione degli analiti in gascromatografia.

La Procedura Operativa Standard (SOP) per questo metodo si concentra sulla descrizione e standardizzazione di un protocollo analitico per la determinazione della composizione volatile dei VOO, con l'obiettivo di supportare la metodologia per la valutazione organolettica dei VOO finalizzata alla loro classificazione merceologica, completando il lavoro  svolto dai panel. Sono stati previsti due metodi analitici, caratterizzati dalla diversa tipologia di rivelatore utilizzato per la quantificazione: rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID - Flame Ionization Detector) e spettrometria di massa (MS - Mass Spectrometry). Gli approcci analitici consentono di determinare i composti volatili presenti nello spazio di testa dei VOO, ma potrebbero essere applicati anche ad altri tipi di oli d’oliva.

Gli obiettivi del pre-trial per il metodo M4A erano sostanzialmente due:

1. Determinare la concentrazione dei 18 composti volatili selezionati in due campioni di olio d'oliva reali, utilizzando una calibrazione realizzata attraverso due matrici standard  contenenti tali molecole a concentrazioni note.
2. Confrontare i risultati dello studio di validazione, ottenuti da laboratori del consorzio OLEUM, con i risultati ottenuti da laboratori esterni, ad esempio comparando i valori della deviazione relativa standard (RSD - Relative Standard Deviation) per ogni composto volatile.

Sette laboratori, tra pubblici e privati, hanno partecipato al pre-trial, tra questi, 2 laboratori dalla Cina, 2 dalla Spagna, 1 dall'Italia, 1 dagli Stati Uniti e 1 dal Portogallo. I partecipanti hanno ricevuto 4 campioni (due olio di oliva vergini e due matrici standard per la calibrazione) e sono stati invitati ad analizzare questi oli seguendola procedura operativa standard (SOP) preparata dagli sviluppatori del metodo. Il metodo è stato presentato ad un workshop tecnico tenutosi nel dicembre 2019 a Bologna, con l'obiettivo di avere una comunicazione diretta con gli utenti finali e di rispondere a domande, fare proposte di miglioramento e raccogliere feedback generali sull'applicazione pratica del metodo e sull'utilità nell’ambito del controllo della qualità dell'olio di oliva vergine.

Lo studio è stato condotto separatamente con i  due tipi di rilevatori, FID e MS, per ottenere informazioni riguardanti le prestazioni dei due diversi metodi. L’ RSD % per ciascuno dei composti volatili è risultata simile al valore RSD% ottenuto dalla validazione inter-laboratorio all’interno del consorzio OLEUM prima del pre-trial. Inoltre, sono state analizzate e identificate le fonti di errore (calibrazione, identificazione, ecc.). Le revisioni della SOP, come conseguenza dei risultati emersi in seguito al pre-trial, sono consistite per lo più nell'introduzione di informazioni utili ad avere una maggiore chiarezza nelle spiegazioni e nei dettagli operativi. Inoltre, è stato utilizzato da tutti i partecipanti allo studio uno stesso file Excel per i calcoli, rivelandosi uno strumento fondamentale per ottenere risultati omogenei dai partecipanti.

La fase di validazione piena (trial proper) si è svolta nell’autunno del 2020.

Per l'Instituto de la Grasa (CSIC): Clemente Ortiz-Romero, Diego L. García-González.

Per l'Alma Mater Studiorum - Università di Bologna (UNIBO): Enrico Casadei, Enrico Valli.

Metodo M3

Determinazione degli esteri etilici degli acidi grassi negli oli di oliva vergini mediante SPE-GC-FID
 

Il metodo M3 è stato sviluppato nell'ambito del WP4 "Soluzioni analitiche per l’autenticità dell'olio d'oliva ", in particolare nel task 4.2 "Identificazione di pratiche illegali (soft-deodorazione): strumenti analitici e marcatori". La procedura analitica consente l'isolamento della frazione che contiene gli esteri etilici degli acidi grassi (EEAG) presenti in oli di oliva vergini (VOO). In questo metodo viene proposta una cartuccia di silice da 1 g per l'isolamento degli analiti come alternativa rapida alla procedura preparatoria definita dall'allegato XX del Reg. CEE 2568/91 per la determinazione delle FAEE, che richiede un elevato volume di solventi e una procedura preparatoria molto lunga e complessa. La frazione isolata viene successivamente analizzata mediante GC-FID utilizzando una colonna a bassa polarità ed un’iniezione a freddo in colonna.
 

L’interesse nei confronti di  tale determinazione risiede nel fatto che la valutazione analitica del contenuto di EEAG rappresenta uno dei parametri qualitativi che permette di definire la qualità di un VOO e di individuare miscele fraudolente di oli extra vergini di oliva con oli di qualità inferiore  (vergini, lampanti o, indirettamente, alcune tipologie di olio soft-deodorato).
 

Lo schema del metodo M3 viene mostrato nella Fig. 1 sottostante. Il metodo è stato validato internamente per quanto riguarda la precisione intra ed inter-giorno, recupero, linearità, robustezza, limite di rilevazione (LOD), limite di quantificazione (LOQ) e precisione.
 

Fig. 1 Schema dell'isolamento della frazione EEAG mediante SPE

La valutazione della concordanza tra i risultati ottenuti applicando il metodo proposto e quelli ottenuti con la procedura di riferimento (allegato XX del Reg. CEE 2568/91) ha dimostrato che i due metodi sono equivalenti.

Nell’ambito del progetto OLEUM, il metodo M3 è stato selezionato per la validazione piena. Alla fase di studio di pre-trial hanno partecipato dieci laboratori a cui sono stati inviati due diversi campioni di olio vergine di oliva, i quali sono stati analizzati seguendo una procedura operativa standard (SOP – standard operation procedure) preparata dagli sviluppatori del metodo. I partecipanti hanno anche avuto l'opportunità di partecipare ad un workshop di addestramento a Siviglia (ottobre 2019). Nel corso di questo workshop hanno posto domande e fornito riscontri sull'applicazione della procedura analitica .

I punti deboli sollevati nello studio di pre-trial sono stati affrontati;  una versione revisionata della SOP è stata realizzata ed inviata, insieme ai campioni, a diciassette laboratori partecipanti al trial proper I risultati ottenuti sono stati raccolti ed elaborati.

Il gruppo di ricerca per lo sviluppo del metodo M3 - Raquel B. Gómez-Coca, Mª del Carmen Pérez-Camino e Wenceslao Moreda (Instituto de la Grasa –CSIC)

Metodo M2

Metodo SPE/GC-FID per la determinazione degli steroli liberi ed esterificati applicato agli oli vegetali
 

Gli oli di oliva vergini sono uno degli alimenti principali della dieta mediterranea. Anche per questo motivo, si tratta di prodotti costosi e, quindi, maggiormente soggetti a pratiche fraudolente. Ad esempio, l'olio extra vergine di oliva (EVOO) è spesso miscelato con altri oli di oliva di qualità inferiore o con oli vegetali più economici, come ad esempio gli oli di semi. In tale contesto, la valutazione analitica della composizione degli steroli rappresenta uno strumento consolidato per la valutazione della purezza degli oli di oliva, in quanto dipende dall'origine botanica degli oli. I metodi che sono disponibili (COI/T.20/Doc. Nº 26, Reg. (CEE) 2568/1991, Annex XIX) sono adatti a determinare la composizione totale degli steroli, non dipendendo dall'essere in forma libera o esterificata. In diversi altri oli vegetali, gli steroli possono essere distribuiti in modo diverso tra queste due forme.

Per questi motivi, è stato proposto un nuovo metodo analitico per la determinazione dei componenti minori liberi e esterificati (cere, esteri alchilici, acidi grassi liberi, steroli liberi ed esterificati, alcoli triterpenici liberi ed esterificati, stireni e tocoferoli liberi ed esterificati) degli oli d'oliva e degli oli di semi. La metodologia, che è focalizzata non solo sulla rilevazione degli steroli liberi ed esterificati, ma anche su alcuni alcoli triterpenici tipici, potrebbe essere utilizzata come strumento di screening per rilevare l'adulterazione degli oli di oliva con oli di semi.
 

La procedura è semplice, rapida e non richiede strumentazioni costose e/o complesse. Consiste in una derivatizzazione diretta degli steroli liberi in derivati silanici. In tal modo, la loro polarità diventa la stessa degli steroli esterificati. Il campione di olio viene frazionato per la rimozione dei triacilgliceroli e di altre interferenze della matrice mediante estrazione in fase solida. La frazione contenente gli steroli liberi ed esterificati viene analizzata mediante analisi GC capillare con iniezione on-column. Il metodo consente di individuare miscele illegali di olio d'oliva con altri  oli vegetali sulla base dei risultati, espressi in percentuale o in concentrazione assoluta, delle forme libere ed esterificate. Va tuttavia sottolineato che il metodo proposto non intende sostituire il metodo degli steroli totali (COI/T.20/Doc. Nº 26, Reg. (CEE) 2568/1991, Annex XIX) , in quanto forniscono diversi tipi di informazioni. I due metodi potrebbero essere complementari, quindi utilizzati insieme per ottenere più informazioni sulla natura del campione di olio e per rafforzare i metodi analitici disponibili per la prevenzione delle frodi.

La procedura analitica è stata validata internamente con una soddisfacente precisione intra-laboratorio espressa come RSD_r compreso tra il 3-6 %. Infine, è stata effettuata la prima parte di uno studio internazionale di validazione del metodo. A tale scopo, dieci laboratori europei, che hanno ricevuto due diversi campioni di olio d'oliva, hanno partecipato ad uno studio iniziale di validazione ("pre-trial"). I partecipanti hanno ricevuto una Procedura Operativa Standard - POS e tutte le istruzioni per la preparazione e la corretta conservazione dei campioni. La precisione inter-laboratorio è stata meno buona di quella osservata durante la validazione interna. Tuttavia, molte delle cause di questi risultati anomali sono state identificate e sono state adottate misure correttive per il processo. È stato, inoltre, ricevuto un feedback importante da parte dei partecipanti con la richiesta di ulteriori informazioni in fase di compilazione del report dello studio di validazione al fine di meglio valutare la capacità dei laboratori di seguire correttamente la procedura analitica.
 

Il pre-trial ha identificato con successo le principali cause dei risultati non soddisfacenti  ed ha portato in questo modo all’inserimento nella Procedura Operativa Standard di dettagli che erano stati inizialmente omessi e che si spera possano determinare risultati migliori durante la fase di validazione che si è svolta nell’autunno del 2020.

Per l'Università degli Studi di Udine: Prof. Paolo Lucci

Metodo M1

Determinazione mediante UHPLC del contenuto totale di idrossitirosolo e tirosolo nell'olio d'oliva in relazione all'indicazione salutistica
 

Il metodo M1 è stato sviluppato nell'ambito delle attività del task "Aumentare la fiducia del consumatore sulle proprietà salutistiche degli oli extra vergini di oliva (EVOO): sviluppo di metodi per la determinazione dei composti fenolici". Tale metodo si basa sulla determinazione mediante UHPLC del contenuto totale di idrossitirosolo (Htyr) e tirosolo (Tyr) nell'olio d'oliva in relazione all'indicazione salutistica introdotta dal regolamento (UE) 432/2012 riguardante i polifenoli dell'olio d'oliva. Questa determinazione mira a quantificare il contenuto totale di idrossitirosolo (Htyr) e tirosolo (Tyr) nella frazione polare dell'olio d'oliva prima e dopo l'idrolisi acida delle loro forme legate. Il contenuto totale di Htyr e Tyr, espresso in mg/20 g di olio, si può quantificare utilizzando standard disponibili in commercio. Per ottenere tale contenuto viene applicata una correzione basata sulle differenze di peso molecolare tra le forme libere e legate di Htyr e Tyr. L'UHPLC è stato utilizzato per velocizzare l'analisi (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(6), 1044; https://doi.org/10.3390/molecules24061044).

Lo schema del metodo M1 viene mostrato nella Fig. 1 sottostante. Il metodo è stato validato internamente per quanto riguarda la specificità, linearità, precisione, recupero e robustezza, compresa la determinazione dei LOD e LOQ degli analiti target. La procedura di estrazione non è stata validata ca differenza di quella proposta dal COI (Consiglio Oleicolo Internazionale) (COI/T.20/Doc. n. 29, 2009) senza l'aggiunta dello standard interno.

 

Fig. 1 Protocollo UHPLC validato internamente, adatto per l’indicazione sulla salute nell'olio d'oliva

I risultati del metodo M1 sono stati confrontati con quelli del metodo COI (Metodo COI/T.20/DOC. 29/Rev. 1 - 2017, Determinazione dei biofenoli negli oli d'oliva mediante il metodo HPLC) come indicato in una recente pubblicazione (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(13), 2429; https://doi.org/10.3390/molecules24132429).

Nell’ambito del progetto OLEUM, il metodo M1 è stato selezionato per essere sottoposto a validazione piena. Alla fase di pre-trial hanno partecipato, tra settembre e dicembre 2019, tredici laboratori provenienti da tutto il mondo (UE, Cina, Stati Uniti d’America ed Australia). I partecipanti hanno ricevuto due diversi campioni di olio vergine di oliva, i quali sono stati analizzati seguendo una procedura operativa standard (SOP - standard operation procedure) predisposta dagli sviluppatori del metodo. I partecipanti hanno anche avuto l'opportunità di partecipare ad un workshop di trasferimento di conoscenze nell'ottobre del 2019 a Siviglia. Nel corso di questo workshop hanno posto domande e fornito un feedback sull'applicazione del protocollo analitico e in particolare sulla SOP.

L'analisi dei dei cromatogrammi e dei rispettivi risultati quantitativi ha permesso di identificare la fase di idrolisi come critica se non vengono seguite le esatte condizioni descritte nella SOP. I punti deboli sollevati nella fase di pre-trial sono stati affrontati nella versione revisionata della SOP inviata ai partecipanti del processo. Inoltre, per facilitare la comprensione del metodo è stato caricato su YouTube un audio-video relativo al metodo M1 che include anche le spiegazioni sui calcoli tramite degli esempi presentati dagli sviluppatori del metodo (https://www.youtube.com/watch?v=-nr45PnLnF4). Le elaborazioni dei risultati dei trial proper sono, ad ora, in corso.

Per il team di sviluppo del metodo dell'Università Aristotele di Salonicco

Maria Z Tsimidou (Professoressa) e Nikolaos Nenadis (Professore assistente)

Introduzione alla sesta newsletter di OLEUM

OLEUM: un aggiornamento su nuovi materiali e metodi per la qualità e l’autenticità dell'olio d'oliva
 

di Tullia Gallina Toschi e Paul Brereton
 

Il mercato dell’olio di oliva (OO) affronta quotidianamente problemi legati alla sua qualità ed autenticità. L'OO e, in particolare, l'olio extra vergine di oliva (EVOO), sono infatti prodotti di altissima qualità dal punto di vista nutrizionale e, nel caso di quest'ultimo, sensoriale. L'EVOO ha un valore di mercato superiore (dal 15% al 100%) rispetto alla categoria merceologica di qualità inferiore rappresentata dall'olio di oliva vergine (VOO). Il valore di mercato è influenzato principalmente dalle caratteristiche sensoriali: per la categoria EVOO, “EXTRA” indica l’assenza di qualsiasi difetto organolettico e rappresenta sia il valore aggiunto del prodotto, che una delle ragioni per cui esso rappresenta un target per i frodatori. Proprio su questo aspetto, infatti, si concentra il maggior numero di non conformità registrate in Europa. Cosa si può fare? L'obiettivo di OLEUM è quello di sviluppare e convalidare metodi che possano affiancare e supportare la valutazione sensoriale, eseguita tramite Panel test, e quindi proteggere il consumatore da false indicazioni riportate sull'etichetta della bottiglia.
 

Considerando che i disallineamenti riscontrati nelle classificazioni sensoriali riguardano principalmente gli oli di oliva EVOO cosiddetti "borderline", ossia vicini al limite tra due categorie, sarebbe molto utile disporre di metodi strumentali a supporto del panel test per identificare e quantificare composti volatili diagnostici, riconducibili ad attributi positivi e negativi. Uno dei metodi proposti per la validazione è la procedura SPME-GC-MS o SPME-GC-FID (Metodo 4A). Tale metodo, che misura specifici composti volatili  (analisi mirata o targeted), è proposto come possibile test complementare in caso di disaccordo tra i panel (Fig. 1). Potrebbe anche essere usato per "anticipare" i risultati del Panel test ossia come misura di screening di garanzia della qualità. Prima di poter utilizzare questo metodo è necessario verificarne i parametri prestazionali, compresa la riproducibilità quantitativa di specifici composti volatili. Per raggiungere questo obiettivo si deve arrivare a stabilire dei limiti e degli intervalli affidabili per i diversi gradi di VOO, che potrebbero poi essere proposti al Consiglio oleicolo internazionale (COI) per l'adozione.
 

Inoltre, OLEUM si propone anche di effettuare uno studio di validazione anche su di un metodo non-targeted, finalizzato quindi all’ottenimento del profilo completo della frazione volatile (Metodo 4B). Negli ultimi anni, molte aziende produttrici di strumenti si sono focalizzate sull’utilizzo di metodi di screening rapidi non-targeted (NTM) per l’autenticazione degli alimenti. La loro implementazione, però, è  stata rallentata proprio dalla mancanza di un processo di validazione formale. OLEUM, producendo materiali di riferimento e realizzando studi comparativi inter-laboratorio sui NTM, contribuisce all’implementazione di queste tecniche analitiche innovative. In questo modo, saremo in grado di confrontare le prestazioni dei metodi sia targeted che non-targeted per la valutazione della frazione volatile.
 

Infine, sono in fase di validazione altri tre metodi nell’ambito del progetto OLEUM; uno (Metodo 1) che quantifica il contenuto in composti fenolici secondo l'indicazione salutistica indicata dall’EFSA (health claim) (Reg. EU 432/2012) ed un secondo (Metodo 2) che misura gli steroli liberi ed esterificati e che potrebbe fornire così ulteriori informazioni utili per l'autenticità e la rilevazione di un’eventuale aggiunta di altri oli vegetali. Un altro metodo in fase di validazione consiste nella revisione del metodo ufficiale per la determinazione degli esteri etilici degli acidi grassi (EEAG); esso prevede una fase preparativa più veloce ossia l'estrazione in fase solida (SPE) al posto dell'attuale procedura tradizionale in colonna (Metodo 3).
 

L’ultima sfida è disporre di materiali di riferimento riconosciuti, convalidati e riproducibili sul mercato  internazionale, in particolare sensoriali. OLEUM sta completando proprio ora uno studio di validazione che valuta l'intensità e l'utilità di due materiali di riferimento specifici: uno per la rilevazione del difetto di avvinato ed uno per il difetto di rancido (Metodo 4C).
 

Fig. 1 Possibile utilizzo di un approccio strumentale “targeted” come strumento di conferma della valutazione sensoriale (Panel Test).

Τελικό συνέδριο για το έργο OLEUM: Μην το χάσετε!

Το έργο OLEUM βρίσκεται κοντά στο τέλος του, και είναι έτοιμο να προσφέρει προσοδοφόρα αποτελέσματα. Το τελικό συνέδριο του OLEUM – «Βελτιωμένες λύσεις για την προστασία της ποιότητας και της αυθεντικότητας του ελαιολάδου» θα λάβει χώρα διαδικτυακά στις 17-18 Φεβρουαρίου του 2021 στις 14:00-17:00 CET (Ώρα Κεντρικής Ευρώπης), γι’ αυτό φροντίστε να κλείσετε αυτές τις ημερομηνίες στο ημερολόγιό σας.
 

Γενικά, στόχος του έργου OLEUM αποτελεί η ουσιαστική εξασφάλιση της ποιότητας και αυθεντικότητας του ελαιολάδου, ενισχύοντας τον εντοπισμό και συμβάλλοντας στην πρόληψη κατά της απάτης στον τομέα του ελαιολάδου. Στο συνέδριο, το OLEUM θα παρουσιαστεί σε όλες τις κύριες πτυχές του:
 

• τις νέες, αναθεωρημένες και επικυρωμένες μεθόδους για τον έλεγχο της ποιότητας και της αυθεντικότητας του ελαιολάδου,
• την Τράπεζα Δεδομένων του OLEUM – ένα εργαλείο πληροφορικής για ελέγχους συμμόρφωσης στον τομέα του ελαιολάδου,
• τη βιωσιμότητα του Δικτύου OLEUM.

Το συνέδριο θα ξεκινήσει με μια παρουσίαση των προόδων που έχουν σημειωθεί στις πολιτικές της ΕΕ, μαζί με την απάντηση του IOC σχετικά με την επικυρωμένη μέθοδο. Τα μελλοντικά μέτρα αντιμετώπισης της απάτης θα εξετασθούν ενδελεχώς με μία συζήτηση, στην οποία θα συμμετέχουν πολλοί ενδιαφερόμενοι.

Εάν σάς ενδιαφέρει ο τομέας του ελαιολάδου, σάς προσκαλούμε θερμά να συμμετάσχετε στην εκδήλωσή μας.

Κάντε κλικ στον σύνδεσμο για να εγγραφείτε σε αυτό το διήμερο συμβάν: https://us02web.zoom.us/webinar/register/WN_ltBgGLzrSjG_6ISt_TfoYA

Πρόγραμμα του τελικού συνεδρίου: http://www.oleumproject.eu/news/article/oleum-final-conference

Για να λαμβάνετε ενημερώσεις, ακολουθήστε το OLEUM στο Twitter (https://twitter.com/oleum_eu?lang=en) ή επισκεφθείτε την ιστοσελίδα του έργου OLEUM (http://www.oleumproject.eu/).

Για περισσότερες πληροφορίες, μπορείτε να στείλετε ένα e-mail στην ηλεκτρονική διεύθυνση oleum@unibo.it

Mέθοδος M4C

Οργανοληπτική ανάλυση παρθένου ελαιολάδου με τη χρήση τεχνητών υλικών αναφοράς

Η μέθοδος M4C αναπτύχθηκε για να ενισχύσει τη μεθοδολογία του IOC για την οργανοληπτική αξιολόγηση των VOO με τη χρήση νέων, τεχνητών, αναπαραγώγιμων και σταθερών Υλικών Αναφοράς (RM), που κατασκευάστηκαν επι τούτου, για να προσομοιώνουν το άρωμα των οργανοληπτικών ελαττωμάτων, τα οποία θα χρησιμοποιηθούν για τη βαθμονόμηση των Πάνελ Οργανοληπτικής Αξιολόγησης (σύμφωνα με τις ενδείξεις που αναφέρονται στον «Οδηγό για την επιλογή, την εκπαίδευση και τον ποιοτικό έλεγχο των δοκιμαστών παρθένου ελαιολάδου-προσόντα των δοκιμαστών, του επικεφαλής του πάνελ και των εκπαιδευτών»). Η Τυποποιημένη Διαδικασία Λειτουργίας (SOP) για αυτή τη μέθοδο επικεντρώθηκε στη συγκέντρωση σχολίων σχετικά με την εφαρμοσιμότητα της χρήσης αυτών των δύο RM ως υποστήριξη στον εντοπισμό και την αξιολόγηση του ελαττώματος για το κρασώδες και του ελαττώματος για το ταγγο στα VOO, καθώς και στην επισήμανση περιστασιακών προβλημάτων και κρίσιμων ζητημάτων που μπορούν να βοηθήσουν στην περαιτέρω βελτίωση των RM.
 

Οι στόχοι της προ-δοκιμής για τη M4C ήταν τρεις: 

i) να αξιολογηθεί η αντιπροσωπευτικότητα των υλικών αναφοράς (RM1 και RM2) όσον αφορά την εκτίμηση από τα μέλη του πάνελ για τη χρησιμότητά τους στην προσομοίωση των αρωμάτων των φυσικών οργανοληπτικών ελαττωμάτων (κρασώδες/ξιδάτο και ταγγό), εκφρασμένη σε ποσοστιαίες τιμές, με την επιλογή «χρήσιμο/μη-χρήσιμο» να δίνεται σε κάθε αξιολογητή)·

ii) να υπολογιστούν οι αντιληπτές εντάσεις του ελαττώματος για το κρασώδες/ξιδάτο και του ελαττώματος για το  ταγγό για τα RM1 και RM2, αντίστοιχα·αυτός ο προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε επειδή ο ορισμός της έντασης κάθε οργανοληπτικού RM αποτελεί θεμελιώδη πληροφορία που επιτρέπει την πιθανή μελλοντική χρήση του στην εκπαίδευση των δοκιμαστών και του ελέγχου των πάνελ με την πάροδο του χρόνου·

iii) να αξιολογηθούν δύο «πραγματικά» δείγματα παρθένου ελαιολάδου ως προς τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά τους, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως δείγματα οργανοληπτικά χαρακτηρισμένα (δείγματα εκπαίδευσης) στο επόμενο βήμα της τελικής δοκιμής αξιολόγησης. Κατά τη δοκιμή, αυτά τα δύο χαρακτηρισμένα δείγματα θα προσφερθούν σε δοκιμαστές για να αναλυθούν ξανά, χρησιμοποιώντας παράλληλα τα δύο RM για να διαπιστωθεί εάν η παροχή συγκεκριμένων προτύπων αναφοράς για το κρασώδες ελάττωμα και το ταγγό μπορεί να βοηθήσει στην αναγνώριση αυτών των χαρακτηριστικών σε δείγματα καθώς και στην ποσοτικοποίηση των εντάσεών τους.

Δέκα δημόσια/ιδιωτικά εργαστήρια, διαθέτοντας εκπαιδευμένο οργανοληπτικό πάνελ για ανάλυση ελαιολάδου, αναγνωρισμένο από εθνικούς/διεθνείς ελεγκτικούς φορείς, συμμετείχαν στην προ-δοκιμή. Από αυτά, 3 ήταν στην Ιταλία, 3 στην Ισπανία, 2 στη Γερμανία, 1 στις ΗΠΑ και 1 στην Αυστραλία. Οι συμμετέχοντες έλαβαν δύο διαφορετικά δείγματα παρθένου ελαιολάδου καθώς και τα δύο RM, και τους ζητήθηκε να τα αναλύσουν ακολουθώντας τη SOP που ετοίμασαν οι επιστήμονες που ανέπτυξαν τη μέθοδο. Οι συμμετέχοντες είχαν επίσης την ευκαιρία να παρακολουθήσουν ένα εκπαιδευτικό σεμινάριο ανταλλαγής γνώσεων τον Δεκέμβριο του 2019 στη Μπολόνια, κατά τη διάρκεια του οποίου έκαναν ερωτήσεις και παρέθεσαν σχόλια σχετικά με την εφαρμογή του αναλυτικού πρωτοκόλλου και ειδικότερα των πληροφοριών της SOP. Τα συμμετέχοντα εργαστήρια δεν ανέφεραν προβλήματα ή δυσκολίες σχετικά με τη SOP, επομένως, δεν εισήχθησαν αλλαγές σε αυτό .

Ο υψηλός αριθμός θετικών απαντήσεων σχετικά με την αντιπροσωπευτικότητα των RM έδειξε συμφωνία ως προς την ομοιότητα με τα φυσικά αρώματα κατά την παρουσίαση αυτών των RM σε διαφορετικά πάνελ. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη τα σχόλια που προήλθαν από τα συμμετέχοντα εργαστήρια για την ανάλυση των RM, καθώς και τα αποτελέσματα που ελήφθησαν σχετικά με τις μέσες τιμές των εντάσεων, το UNIBO και το CSIC αποφάσισαν να επιλέξουν και να προετοιμάσουν για την τελική δοκιμή αξιολόγησης, μίγματα RM προς αξιολόγηση (μόνο οσφρητική) που είναι περισσότερο αραιωμένα από αυτά που διανεμήθηκαν κατά την προ-δοκιμή.

Για το Alma Mater Studiorum – University of Bologna (Πανεπιστήμιο της Μπολόνιας) (UNIBO): Καθηγήτρια Alessandra Bendini

Για το Instituto de la Grasa (CSIC): Δρ. Diego Luis García González

Mέθοδος M4B

Μη στοχευμένη προσέγγιση για την ανάλυση του πτητικού αποτυπώματος του παρθένου ελαιολάδου με τη χρήση SPME-GC-MS και χημειομετρίας

Η μέθοδος περιγράφει μια κατάλληλη στρατηγική ελέγχου για τον διαχωρισμό του παρθένου ελαιολάδου στις κατηγορίες ποιότητας «Εξαιρετικά παρθένο», «Παρθένο» ή «Λαμπάντε» με σκοπό την υποστήριξη των πάνελ οργανοληπτικής αξιολόγησης περιορίζοντας τον φόρτο εργασίας τους στα δείγματα με  «οριακές» τιμές και βελτιώνοντας συνεπώς την απόδοσή τους¹. Βασίζεται σε ένα μοντέλο ιεραρχικής ταξινόμησης που δημιουργήθηκε με βάση το πτητικό αποτύπωμα των δειγμάτων VOO, το οποίο προέκυψε από μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (SPME), και τον επακόλουθο διαχωρισμό των ενώσεων στόχων με αέρια χρωματογραφία συζευγμένη με  φασματομετρία μάζας (MS).

Ομοφωνία σχετικά με τη διαδικασία επικύρωσης αναλυτικών μεθόδων οι οποίες βασίζονται σε καταγραφή του δακτυλικού αποτυπώματος, όπως η παρούσα, εξακολουθεί να μην υφίσταται, ενώ δεν έχουν καθοριστεί ακριβείς οδηγίες². Επομένως, προβήκαμε σε μια μελέτη επικύρωσης που επικεντρώνεται στην αξιολόγηση του σήματος χωρίς κάποια επεξεργασία που παρέχεται από τους συμμετέχοντες, κατανοώντας τη μεταβλητότητα και τις πηγές σφάλματος που θα βοηθήσουν στη κατασκευή ενός αξιόπιστου μοντέλου ταξινόμησης στο μέλλον. Ο κύριος περιορισμός της αναλυτικής μεθόδου που καταγράφει ένα δακτυλικό αποτύπωμα έγκειται στην αδυναμία λήψης ενός επαναλήψιμου και αναπαραγώγιμου χρωματογραφικού σήματος με αρκετή ευαισθησία για τη συλλογή των πολύτιμων πληροφοριών από τα δείγματα, επομένως, η ενδο- και η διεργαστηριακή επαναληψιμότητα εξετάστηκε για τους 4 συμμετέχοντες.

Πρώτον, η επαναληψιμότητα εντός της ημέρας του κάθε συμμετέχοντος αξιολογήθηκε υπολογίζοντας τη Σχετική Τυπική Απόκλιση (RSD) του σήματος σε κάθε καταγεγραμμένο σημείο  - εξαιρουμένου του θορύβου - του χρωματογραφήματος του συνολικού ρεύματος ιόντων (TIC). Όλοι οι συμμετέχοντες σημείωσαν RSD <20% σε περισσότερα από το 95% των σημάτων. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μια αντιστρόφως ανάλογη σχέση μεταξύ των τιμών RSD% και της έντασης του σήματος κατά τη καταγραφή τους, σε συμφωνία με την εξίσωση Horwitz³.

Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η διεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα με ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA), μετά την ομαλοποίηση και την ευθυγράμμιση του σήματος για να επιλυθεί το πρόβλημα της μετατόπισης του χρόνου κατακράτησης των ίδιων σημείων του χρωματογραφήματος από δείγμα σε δείγμα. Η PCA οδήγησε σε ικανοποιητική ομαδοποίηση κάθε προ-δοκιμαστικού δείγματος, δίνοντας ένα ακριβές αναλυτικό αποτέλεσμα (Σχήμα 1). Επιπλέον, η ομάδα με το ενοποιημένο δείγμα ελέγχου ποιότητας (QC) βρέθηκε κοντά στο δείγμα QC που αναλύθηκε προηγουμένως από τους επιστήμονες που ανέπτυξαν τη μέθοδο, δείχνοντας μια ικανοποιητική αναπαραγωγιμότητα. Η εγγύτητα μεταξύ της ομάδας του του ενοποιημένου δείγματος QC και των δειγμάτων Εξαιρετικού Παρθένου και Λαμπάντε που χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία του ενοποιημένου QC, υποδηλώνει μια ισχυρότερη βαρύτητα των μεταβλητών που σχετίζονται με αυτά τα οργανοληπτικά προφίλ.

Στο πλαίσιο αυτό, τα αποτελέσματα που προέκυψαν στην προ-δοκιμή ήταν υποσχόμενα, ο τύπος και ο βαθμός μεταβλητότητας μεταξύ των σημάτων έχουν αξιολογηθεί, ενώ έχουν εντοπιστεί και ορισμένες πηγές σφάλματος. Ο περιορισμένος αριθμός συμμετεχόντων και δειγμάτων εμπόδισε τη δυνατότητα να αποτυπωθεί καλύτερα η μεταβλητότητα λόγω οργανολογίας και ανάλυσης.
 

Σχήμα 1. Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA) στις σχετικές εντάσεις TIC (κανονικοποιημένες, χωρίς κλιμάκωση) από: δείγματα της προ-δοκιμής που αναλύθηκαν από τους συμμετέχοντες (10, OLPT_M4b_010 συγκεντρωτικό QC· 11, OLPT_M4b_011- Έλαιο Λαμπάντε,·δείγματα που αναλύθηκαν από το εργαστήριο αναφοράς κατά τη διάρκεια της ενδοεργαστηριακής επικύρωσης (QC_VAL, συγκεντρωτικό QC· EV_RSs, Δείγματα Αναφοράς Εξαιρετικά Παρθένο, L_RSs, Δείγματα Αναφοράς Λαμπάντε).

Σημείωση: Χαρακτηριστικά PCA: 2PC, 89,4% της εξηγούμενης συνολικής διακύμανσης.

Για την ομάδα ανάπτυξης του Πανεπιστημίου της Βαρκελώνης): Stefania Vichi και Alba Tres

Mέθοδος M4A

Στοχευμένη προσέγγιση για τον προσδιορισμό των πτητικών ενώσεων στο παρθένο ελαιόλαδο χρησιμοποιώντας αέρια χρωματογραφία (μέθοδος M4A)

Η μέθοδος M4A αναπτύχθηκε για τον προσδιορισμό του περιεχομένου 18 επιλεγμένων πτητικών ενώσεων σε παρθένα ελαιόλαδα (VOO), οι οποίες είναι υπεύθυνες για το άρωμα και τα οργανοληπτικά ελαττώματα. Ο προσδιορισμός βασίζεται στην απομόνωση και την προ-συγκέντρωση πτητικών με μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (SPME) και τον επακόλουθο διαχωρισμό των ενώσεων στόχων με αέρια χρωματογραφία.

Η Τυποποιημένη Διαδικασία Λειτουργίας (SOP) για αυτή τη μέθοδο επικεντρώθηκε στην περιγραφή και την προτυποποίηση ενός αναλυτικού πρωτοκόλλου για τον προσδιορισμό της σύνθεσης των πτητικών ενώσεων του VOO, με τελικό σκοπό/στόχο την ενίσχυση της μεθοδολογίας του IOC για την οργανοληπτική αξιολόγηση και ταξινόμηση των VOO, υποστηρίζοντας και συμπληρώνοντας το ρόλο των πάνελ οργανοληπτικής αξιολόγησης. Προτάθηκαν  δύο μέθοδοι ανάλογα με τον ανιχνευτή που χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση: ο ανιχνευτής ιονισμού φλόγας (FID) και η φασματομετρία μάζας (MS). Όπως υπονοείται από τη χρήση της SPME, η μέθοδος προσδιορίζει τις πτητικές ενώσεις στην υπερκείμενη των δειγμάτων VOO αέρια φάση, αν και θα μπορούσε να εφαρμοστεί και σε άλλες κατηγορίες ελαιολάδου.

Στόχοι της προ-δοκιμής για τη M4A ήταν:

1. Για την ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης των 18 επιλεγμένων πτητικών ενώσεων σε δύο «πραγματικά» δείγματα ελαιολάδου, η βαθμονόμηση έγινε με βάση δύο προηγουμένως παρασκευασμένων καθορισμένων υποστρωμάτων με γνωστή συγκέντρωση αυτών των πτητικών ενώσεων.
2. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων από τη διεργαστηριακή μελέτη επαλήθευσης που έγινε εντός του OLEUM με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από εργαστήρια εκτός της κοινοπραξίας, έγινε εξετάζοντας τις τιμές σχετικής τυπικής απόκλισης (RSD) για κάθε πτητική ένωση που αναφέρθηκε από τα διαφορετικά συμμετέχοντα εργαστήρια.

Επτά δημόσια/ιδιωτικά εργαστήρια συμμετείχαν στην προ-δοκιμή. Από αυτά, 2 ήταν από την Κίνα, 2 από την Ισπανία, 1 από την Ιταλία, 1 από τις ΗΠΑ και 1 από την Πορτογαλία. Οι συμμετέχοντες έλαβαν 4 δείγματα (δύο δείγματα παρθένου ελαιολάδου και δύο υποστρώματα με πρότυπα για τη βαθμονόμηση) και τους ζητήθηκε να τα αναλύσουν ακολουθώντας τη SOP που ετοίμασαν οι επιστήμονες που ανέπτυξαν τη μέθοδο. Αυτή η μέθοδος παρουσιάστηκε σε ένα εκπαιδευτικό σεμινάριο σε τον Δεκέμβριο του 2019 στη Μπολόνια με στόχο την άμεση επικοινωνία με τους τελικούς χρήστες (επαγγελματίες στην ανάλυση παρθένου ελαιολάδου) και την απάντηση σε ερωτήσεις, αμφιβολίες, τη συζήτηση προτάσεων βελτίωσης, καθώς και τη λήψη γενικών σχολίων σχετικά με την πρακτική εφαρμογή και χρησιμότητά της στον ποιοτικό έλεγχο του παρθένου ελαιολάδου.

Η μελέτη διεξάγεται ξεχωριστά για τα δύο είδη ανιχνευτών, FID και MS, προκειμένου να υπάρχουν πληροφορίες σχετικά με την απόδοση των μεθόδων με αυτές τις δύο επιλογές. Η RSD% για κάθε μία από τις πτητικές ενώσεις ήταν παρόμοια με την τιμή RSD% που ελήφθη από την διεργαστηριακή εξέταση που πραγματοποιήθηκε εντός της κοινοπραξίας OLEUM πριν από την προ-δοκιμή. Αναλύθηκαν και εντοπίστηκαν επίσης πηγές σφαλμάτων (βαθμονόμηση, ταυτοποίηση κ.λπ.). Οι αναθεωρήσεις στην SOP ως συνέπεια της προ-δοκιμής σχετίζονταν κυρίως με την εισαγωγή πληροφοριών για περαιτέρω σαφήνεια στις εξηγήσεις και τις λεπτομέρειες. Η χρήση ενός εναρμονισμένου αρχείου Excel για όλους τους υπολογισμούς κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης αποδείχθηκε κρίσιμο εργαλείο για τη λήψη ομοιογενών δεδομένων.

Για το Instituto de la Grasa (CSIC): Clemente Ortiz-Romero, Diego L. García-González.

Για το Alma Mater Studiorum – University of Bologna (Πανεπιστήμιο της Μπολόνια) (UNIBO): Enrico Casadei, Enrico Valli.

Mέθοδος M3

Προσδιορισμός των αιθυλεστέρων λιπαρών οξέων σε παρθένα ελαιόλαδα με τη χρήση της SPE-GC-FID
 

Η μέθοδος M3 αναπτύχθηκε ως μέρος του πακέτου εργασίας 4 «Αναλυτικές λύσεις που αντιμετωπίζουν ζητήματα ελέγχου γνησιότητας ελαιολάδου», ειδικά στο πλαίσιο της ενότητας εργασίας 4.2 «Εντοπισμός παράνομης επεξεργασίας (απόσμησης): αναλυτικά εργαλεία και δείκτες». Η διαδικασία επιτρέπει την απομόνωση του κλάσματος που περιέχει τους αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων (FAEE) που υπάρχουν σε δείγματα παρθένου ελαιολάδου (VOO). Σε αυτήν τη μέθοδο, προτείνεται η χρήση μιας μικροστήλης πληρωμένης με διοξείδιο του πυριτίου (1γρ.) για την απομόνωση της αναλυτέας ουσίας ως ταχεία εναλλακτική λύση έναντι της προπαρασκευαστικής φάσης που ορίζεται στο Παράρτημα XX του κανονισμού ΕΟΚ. 2568/91 για τον προσδιορισμό των FAEE, η οποία απαιτεί μεγάλο όγκο διαλυτών και μια πολύ μακρά και πολύπλοκη προπαρασκευαστική διαδικασία. Το απομονωμένο κλάσμα στη συνέχεια αναλύεται με τη μέθοδο GC-FID χρησιμοποιώντας στήλη χαμηλής πολικότητας και ψυχρή έγχυση στη στήλη.
 

Το ενδιαφέρον μας για αυτόν τον προσδιορισμό έγκειται στο γεγονός ότι η αναλυτική αξιολόγηση του περιεχομένου των FAEE είναι μία από τις παραμέτρους ποιότητας που επιτρέπει τον καθορισμό της ποιότητας ενός VOO και την ανίχνευση μη επιτρεπόμενων μιγμάτων εξαιρετικά παρθένων ελαιολάδων με έλαια χαμηλότερης ποιότητας, είτε αυτά είναι παρθένα, λαμπάντε ή, έμμεσα, κάποιο είδος ελαίων που έχουν υποστεί ήπια απόσμηση.
 

Τα στάδια της μεθόδου M3 φαίνονται στο Σχ. 1. Η μέθοδος έχει επικυρωθεί εσωτερικά όσον αφορά την πιστότητα εντός της ίδιας ημέρας ή και σε διαφορετικές, ανάκτηση, γραμμικότητα, ανθεκτικότητα, όριο ανίχνευσης (LOD) και όριο ποσοτικού προσδιορισμού (LOQ), καθώς και την ακρίβεια.
 

Σχ. 1 Στάδια απομόνωσης του κλάσματος των FAEE μέσω SPE

Ο προσδιορισμός του βαθμού συμφωνίας μεταξύ των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν με την εφαρμογή της προτεινόμενης μεθόδου και εκείνων που προέκυψαν με τη μέθοδο αναφοράς (Παράρτημα ΧΧ του Κανονισμού ΕΟΚ 2568/91 για τον προσδιορισμό των FAEE) απέδειξε την ισοδυναμία των μεθόδων.

Σύμφωνα με τις διαδικασίες του έργου OLEUM, επιλέχθηκε η μέθοδος M3 για πλήρη επικύρωση, η οποία περιλάμβανε τη συμμετοχή δέκα εργαστηρίων σε μια προ-δοκιμαστική μελέτη, όπου οι συμμετέχοντες έλαβαν δύο διαφορετικά δείγματα εξαιρετικά παρθένου ελαιολάδου και τους ζητήθηκε να τα αναλύσουν ακολουθώντας την τυποποιημένη διαδικασία λειτουργίας (SOP) που προετοιμάστηκε από τους επιστήμονες που ανέπτυξαν την μέθοδο. Οι συμμετέχοντες είχαν επίσης την ευκαιρία να παρακολουθήσουν ένα εκπαιδευτικό εργαστήριο μεταφοράς τεχνογνωσίας στη Σεβίλλη (Οκτώβριος 2019), κατά τη διάρκεια του οποίου έκαναν ερωτήσεις και παρείχαν σχόλια σχετικά με την εφαρμογή της SOP.

Τα αδύνατα σημεία που προέκυψαν στην προ-δοκιμαστική μελέτη αντιμετωπίστηκαν στην αναθεωρημένη έκδοση της SOP που διαβιβάστηκε στους δεκαεπτά συμμετέχοντες της τελικής δοκιμής αξιολόγησης, των οποίων τα αποτελέσματα συλλέγονται επί του παρόντος.

Instituto de la Grasa -CSIC- Ομάδα ανάπτυξης μεθόδου M3 - Raquel B. Gómez-Coca, Mª del Carmen Pérez-Camino και Wenceslao Moreda

Mέθοδος M2

Μέθοδος SPE/GC-FID για την ανίχνευση των ελεύθερων και των εστεροποιημένων στερολών
 

Τα παρθένα ελαιόλαδα είναι από τα κύρια συστατικά της Mεσογειακής διατροφής. Για το λόγο αυτό, μπορεί να είναι αρκετά ακριβά προϊόντα, ενώ οι νοθείες αποτελούν συχνό φαινόμενο. Για παράδειγμα, τα EVOO συχνά αραιώνονται με άλλα ελαιόλαδα κατώτερης ποιότητας ή με φθηνότερα φυτικά έλαια, όπως τα σπορέλαια. Σε αυτό το πλαίσιο, η αναλυτική αξιολόγηση της σύνθεσης των στερολών είναι ένα καθιερωμένο εργαλείο για την αξιολόγηση της καθαρότητας των ελαιολάδων, καθώς εξαρτάται από τη βοτανική προέλευση των ελαίων. Οι διαθέσιμες μέθοδοι (COI/T.20/Doc. Nº 26, Reg. (CEE) 2568/1991, Annex XIX) είναι κατάλληλες για τον προσδιορισμό της συνολικής σύστασης των στερολών, χωρίς να εξαρτάται από το εάν αυτές είναι σε ελεύθερη ή σε εστεροποιημένη μορφή. Σε διαφορετικά φυτικά έλαια, οι στερόλες μπορούν να κατανεμηθούν διαφορετικά μεταξύ αυτών των δύο μορφών.

Για τους λόγους αυτούς, έχει προταθεί μια νέα αναλυτική μέθοδος για τον προσδιορισμό τόσο των ελευθέρων, όσο και των εστεροποιημένων δευτερογενών συστατικών (κηροί, αλκυλεστέρες, ελεύθερες λιπαρές αλκοόλες, ελεύθερες και εστεροποιημένες στερόλες, ελεύθερες και εστεροποιημένες τριτερπενικές αλκοόλες, στυρένια, ελεύθερες και εστεροποιημένες τοκοφερόλες) των ελαιολάδων και σπορελαίων. Η μεθοδολογία, η οποία επικεντρώνεται όχι μόνο στην ανίχνευση ελεύθερων και εστεροποιημένων στερολών, αλλά και ορισμένων χαρακτηριστικών τριτερπενικών αλκοολών, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο ελέγχου για την ανίχνευση της νοθείας με σπορέλαια.
 

Η διαδικασία είναι αρκετά απλή, γρήγορη και δεν απαιτεί ακριβή ή/και πολύπλοκη οργανολογία. Αποτελείται από μια άμεση παραγωγοποίηση των ελεύθερων στερολών σε δείγματα ελαίου που μετατρέπονται σε σίλυλο παράγωγα. Με αυτόν τον τρόπο, η πολικότητά τους γίνεται ίδια με αυτή των εστεροποιημένων στερολών. Το δείγμα ελαίου συνεπώς κλασματώνεται για την απομάκρυνση των τριακυλγλυκερολών και άλλων παρεμποδίσεων του υποστρώματος με εκχύλιση στερεάς φάσης, ενώ το κλάσμα που περιέχει ελεύθερες και εστεροποιημένες στερόλες αναλύεται με τριχοειδή αέρια χρωματογραφία και έγχυση στη στήλη. Η μέθοδος έχει τη δυνατότητα να ανιχνεύει μη επιτρεπόμενα μείγματα ελαιολάδου και άλλων φυτικών ελαίων με βάση τα αποτελέσματα που εκφράζονται ως ποσοστά ή απόλυτη συγκέντρωση σε ελεύθερες και εστεροποιημένες μορφές. Πρέπει να τονιστεί, ωστόσο, ότι η προτεινόμενη μέθοδος δεν προορίζεται να αντικαταστήσει τη μέθοδο ολικών στερολών (COI/T.20/Doc. Nº 26, Reg. (CEE) 2568/1991, Annex XIX), δεδομένου ότι παρέχουν διαφορετικές πληροφορίες. Οι δύο μέθοδοι θα μπορούσαν να είναι συμπληρωματικές και να χρησιμοποιούνται μαζί για την απόκτηση περισσότερων πληροφοριών σχετικά με τη φύση του δείγματος ελαίου και επομένως να ενισχύσουν τις διαθέσιμες αναλυτικές μεθόδους για τον περιορισμό της νοθείας.

Η αναλυτική διαδικασία έχει επικυρωθεί εσωτερικά με ικανοποιητική ενδοεργαστηριακή πιστότητα με RSD_r που κυμαίνεται μεταξύ 3-6%. Στη συνέχεια, εκτελέστηκε το πρώτο μέρος επικύρωσης της μεθοδολογίας σε διεθνές επίπεδο. Για τον σκοπό αυτό, δέκα Ευρωπαϊκά εργαστήρια, τα οποία έλαβαν δύο διαφορετικά δείγματα ελαιολάδου, συμμετείχαν στην αρχική «προ-δοκιμαστική» μελέτη. Οι συμμετέχοντες έλαβαν μια Τυποποιημένη Διαδικασία Λειτουργίας (SOP) καθώς και οδηγίες για την προετοιμασία και αποθήκευση των δειγμάτων. Η διεργαστηριακή πιστότητα ήταν υποδεέστερη από αυτήν που βρέθηκε στην εσωτερική επικύρωση. Ωστόσο, πολλές από τις αιτίες αυτών των ανώμαλων αποτελεσμάτων έχουν εντοπιστεί και έχουν ληφθεί διορθωτικά μέτρα για την τελική δοκιμή αξιολόγησης. Ελήφθησαν επίσης πολύτιμα σχόλια από τους συμμετέχοντες σχετικά με την περιγραφή λεπτομερειών που πρέπει να δηλώνονται από τα εργαστήρια που συμπεριλήφθηκαν στην SOP για την σωστή πραγματοποίηση της τελικής δοκιμής αξιολόγησης, ώστε να εκτιμηθεί καλύτερα εάν τα αποτελέσματα που θα αναφέρουν τα εργαστήρια ακολουθούν σωστά την SOP.
 

Η προ-δοκιμή έχει εντοπίσει επιτυχώς τις αιτίες των παρεκκλίσεων που παρατηρούνται στα αποτελέσματα και επέτρεψε την εισαγωγή αρκετών βελτιώσεων, δίνοντας ελπίδες για το ότι τα δεδομένα σχετικά με την επίδοση της μεθόδου κατά την τελική δοκιμή αξιολόγησης, η οποία πρόκειται να ξεκινήσει τον Σεπτέμβριο του 2020, θα είναι ικανοποιητικά.

Για το University of Udine (Πανεπιστήμιο του Ούντινε): Paolo Lucci

Mέθοδος M1

Προσδιορισμός της συνολικής περιεκτικότητας σε υδροξυτυροσόλη και τυροσόλη στο ελαιόλαδο για την υποστήριξη  του ισχυρισμού υγείας με χρωματογραφία υπερυψηλής πίεσης [UHPLC]
 

Η μέθοδος M1 που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο της ενότητας εργασίας «Αυξάνοντας την εμπιστοσύνη των καταναλωτών ως προς τις ιδιότητες υγείας του EVOO: ανάπτυξη μεθόδων για τον προσδιορισμό των φαινολικών ενώσεων» είναι ο προσδιορισμός UHPLC (χρωματογραφία υπερυψηλής πίεσης) της συνολικής περιεκτικότητας σε υδροξυτυροσόλη και τυροσόλη στο ελαιόλαδο που είναι κατάλληλη για για την υποστήριξη του ισχυρισμού υγείας που εισήχθη με τον κανονισμού της ΕΕ 432/2012 για τις «πολυφαινόλες ελαιολάδου». Στοχεύει στην ποσοτικοποίηση της συνολικής περιεκτικότητας υδροξυτυρόλης (Htyr) και τυροσόλης (Tyr) στο πολικό κλάσμα του ελαιολάδου πριν και μετά την όξινη υδρόλυση των δεσμευμένων μορφών τους. Αυτή η περιεκτικότητα μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με ακρίβεια χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα πρότυπα και εκφράζεται ως ολική Htyr και Tyr (mg/20 g ελαίου) μετά από διόρθωση με κατάλληλους συντελεστές εξαιτίας της διαφοράς μοριακού βάρους μεταξύ ελεύθερων και δεσμευμένων μορφών. Η UHPLC έχει χρησιμοποιηθεί για να επιταχύνει την ανάλυση (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24 (6), 1044; https://doi.org/10.3390/molecules24061044).
 

Η μέθοδος Μ1 που απεικονίζεται γραφικά στο Σχ. 1 έχει επικυρωθεί ενδοεργαστηριακά όσον αφορά την ειδικότητα, τη γραμμικότητα, την πιστότητα, την ανάκτηση και την ανθεκτικότητα, συμπεριλαμβανομένου του προσδιορισμού του ορίου ανίχνευσης (LOD) και του ορίου ποσοτικοποίησης (LOQ) των ενώσεων-στόχων. Η διαδικασία εκχύλισης δεν επικυρώθηκε καθώς είναι αυτή που πρότεινε το ΔΣΕ (COI/T.20/Doc. No. 29, 2009), αλλά χωρίς την προσθήκη του εσωτερικού προτύπου.
 

Σχ. 1  Ενδοεργαστηριακά επικυρωμένο πρωτόκολλο UHPLC που είναι κατάλληλο για την την υποστήριξη του ισχυρισμού υγείας στο ελαιόλαδο
 

Τα αποτελέσματα της μεθόδου Μ1 έχουν συγκριθεί με αυτά που προέκυψαν από την εφαρμογή της μεθόδου του ΔΣΕ (Μέθοδος COI/T.20/DOC. 29/Rev. 1 – 2017, Προσδιορισμός των βιοφαινολών στα ελαιόλαδα με χρωματογραφία υψηλής πίεσης [HPLC]) όπως παρουσιάστηκε σε μια πρόσφατη δημοσίευση (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(13), 2429; https://doi.org/10.3390/molecules24132429).
 

Σύμφωνα με τις διαδικασίες του έργου OLEUM, η μέθοδος M1 επιλέχθηκε για πλήρη επικύρωση που πραγματοποιείται σε δύο κύκλους. Στην προ-δοκιμαστική μελέτη συμμετείχαν δεκατρία εργαστήρια από την ΕΕ, την Κίνα, τις ΗΠΑ και την Αυστραλία από τον Σεπτέμβριο
 

μέχρι τον Δεκέμβριο του 2019. Οι συμμετέχοντες έλαβαν δύο διαφορετικά δείγματα εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου και τους ζητήθηκε να τα αναλύσουν ακολουθώντας μια τυποποιημένη διαδικασία λειτουργίας (SOP) που προετοίμασαν οι ερευνητές που ανέπτυξαν την μέθοδο. Οι συμμετέχοντες είχαν επίσης την ευκαιρία να παρακολουθήσουν ένα εκπαιδευτικό σεμινάριο μεταφοράς τεχνογνωσίας τον Οκτώβριο του 2019 στη Σεβίλλη, κατά τη διάρκεια του οποίου έκαναν ερωτήσεις και εξέφρασαν τη γνώμη τους σχετικά με την εφαρμογή του αναλυτικού πρωτοκόλλου και ειδικότερα των πληροφοριών που περιλαμβάνονται στη SOP.
 

Η μέτα-ανάλυση των χρωματογραφημάτων και των αντίστοιχων ποσοτικών αποτελεσμάτων ανέδειξαν την κρισιμότητα του σταδίου της υδρόλυσης σε περίπτωση που δεν τηρούνται οι ακριβείς οδηγίες που δίνονται στη SOP. Τα αδύνατα σημεία που αναδείχθηκαν κατά την προ-δοκιμαστική μελέτη αντιμετωπίστηκαν στην αναθεωρημένη έκδοση της SOP που στάλθηκε στους συμμετέχοντες της τελικής δοκιμής αξιολόγησης. Επιπλέον, μέσω του OLEUM, είναι διαθέσιμο στο YouTube οπτικοακουστικό υλικό με περιγραφή της μεθόδου M1, που δημιουργήθηκε από τους επιστήμονες που την ανέπτυξαν και επιπλέον περιλαμβάνει επεξηγήσεις για τους υπολογισμούς μέσω παραδείγματος (https://www.youtube.com/watch?v=-nr45PnLnF4) για τη διευκόλυνση της εκπαίδευσης των ενδιαφερομένων μερών. Πλέον, συνεχίζεται το στάδιο της τελικής δοκιμής αξιολόγησης.
 

Για την ομάδα ανάπτυξης της μεθόδου Μ1 του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου

Μαρία Ζ. Τσιμίδου (Καθηγήτρια) και Νικόλαος Νενάδης (Επίκουρος Καθηγητής)

Εισαγωγή στο έκτο ενημερωτικό δελτίο OLEUM

OLEUM: ενημέρωση για νέες μεθόδους και υλικά για τη διαχείριση της ποιότητας και της γνησιότητας του ελαιολάδου
 

Από την Tullia Gallina Toschi και τον Paul Brereton
 

Ο κόσμος του ελαιολάδου αντιμετωπίζει καθημερινά προβλήματα που σχετίζονται με την ποιότητα και την γνησιότητά του. Το ελαιόλαδο και, ειδικότερα, το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο (EVOO), είναι προϊόντα υψηλής ποιότητας όσον αφορά τη διατροφική αξία και, στην περίπτωση του τελευταίου, τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Το EVOO έχει υψηλότερη εμπορική αξία, (15 έως 100%) από την υποδεέστερη κατηγορία του παρθένου ελαιολάδου (VOO). Αυτή η αξία οφείλεται κυρίως στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, καθώς το «ΕΞΑΙΡΕΤΙΚΑ» σημαίνει την απουσία οργανοληπτικών ελαττωμάτων. Πράγματι, λόγω της αυξημένης προστιθέμενης αξίας, η σήμανση «ΕΞΑΙΡΕΤΙΚΑ» αποτελεί στόχο εκμετάλλευσης από διαφόρους απατεώνες. Αυτό επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι ο μεγαλύτερος αριθμός μη συμμορφώσεων που καταγράφονται στην Ευρώπη αφορούν την οργανοληπτική ποιότητα. Τι μπορούμε να κάνουμε; Στόχος της OLEUM είναι να αναπτύξει και να επικυρώσει μεθόδους που μπορούν να βοηθήσουν και να υποστηρίξουν την οργανοληπτική αξιολόγηση, δηλαδή το «Πάνελ Τεστ», και έτσι να προστατεύσουν τον καταναλωτή από ψευδείς ισχυρισμούς στην ετικέτα της φιάλης.
 

Δεδομένου ότι οι μεγαλύτερες διαφωνίες κατά την οργανοληπτική ταξινόμηση εντοπίζονται στις λεγόμενες «οριακές γραμμές» της ποιότητας του EVOO, είναι πολύ χρήσιμο να έχουμε ενόργανες μεθόδους για τον εντοπισμό και την ποσοτικοποίηση των βασικών πτητικών ενώσεων που συμβάλλουν στην οργανοληπτική ανάλυση. Μία από τις μεθόδους που προτείνονται για επικύρωση είναι μια μέθοδος SPME-GC / MS ή SPME-GC / FID (Μέθοδος 4Α). Αυτή η στοχευμένη μέθοδος (η οποία μετρά συγκεκριμένες «ενώσεις-στόχους») προτείνεται να χρησιμοποιηθεί ως ενδεχόμενη συμπληρωματική δοκιμή σε περίπτωση διαφωνίας μεταξύ των πάνελ (Εικ. 1). Τελικά θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί για την «πρόβλεψη» των αποτελεσμάτων του πάνελ τεστ ως μέτρο διασφάλισης ποιότητας. Προτού κριθεί κατάλληλη για χρήση, είναι απαραίτητο να επαληθευτεί η επίδοση της μεθόδου της διαδικασίας, συμπεριλαμβανομένης της αναπαραγωγιμότητας της ποσοτικοποίησης συγκεκριμένων πτητικών ενώσεων. Αυτό θα επιτρέψει τον καθορισμό αξιόπιστων ορίων και ευρών για τις διαφορετικές κατηγορίες VOO με βάση την ποιότητα που θα μπορούσαν να παρουσιαστούν στο Διεθνές Συμβούλιο Ελαιολάδου (ΔΟΕ) προς υιοθέτηση.
 

Επιπλέον, το έργο OLEUM προτείνει τη διεξαγωγή μίας από τις πρώτες μελέτες που στοχεύουν στην ανάπτυξη κριτηρίων επίδοσης μεθόδου για μια μη-στοχευμένη μέθοδο (όπου η εστίαση είναι στη λήψη και σύγκριση των προφίλ των πτητικών ενώσεων) (Μέθοδος 4Β). Πολλές εταιρείες οργάνων έχουν προτείνει, τα τελευταία χρόνια, την επιβεβαίωση της γνησιότητας τροφίμων χρησιμοποιώντας ταχείες μη στοχευμένες μεθόδους (NTM), ωστόσο η εφαρμογή τους έχει παρεμποδιστεί από την έλλειψη επίσημης διαδικασίας επικύρωσης. Το Oleum συμβάλλει σε αυτόν τον νέο τομέα με την παραγωγή υλικών αναφοράς και τη διεξαγωγή διεργαστηριακών μελετών σύγκρισης NTM. Με αυτόν τον τρόπο θα είμαστε σε θέση να συγκρίνουμε την επίδοση τόσο των στοχευμένων, όσο και των μη-στοχευμένων μεθόδων για την αξιολόγηση των πτητικών, κάνοντας ένα βήμα πιο κοντά προς την εφαρμογή των NTM
 

Τέλος, επικυρώνονται τρεις ακόμα μέθοδοι στο πλαίσιο του OLEUM, μία (Μέθοδος 1) που μετρά τις «πολυφαινόλες» σύμφωνα με τον ισχυρισμό υγείας (Κανονισμός ΕΕ 432/2012) και μια δεύτερη (Μέθοδος 2) που μετρά τις ελεύθερες και εστεροποιημένες στερόλες παρέχοντας έτσι πρόσθετες χρήσιμες πληροφορίες για την γνησιότητα και την ανίχνευση της προσθήκης άλλων φυτικών ελαίων. Μια άλλη μέθοδος που είναι στο στάδιο της επικύρωσης είναι η αναθεωρημένη επίσημη μέθοδος για τον προσδιορισμό των αιθυλεστέρων των λιπαρών οξέων (FAEEs), χρησιμοποιώντας μια βελτιωμένη ταχύτερη διαδικασία με τη χρήση της διαδικασίας Εκχύλισης Στερεάς Φάσης (SPE), αντί της τρέχουσας παραδοσιακής διαδικασίας με τη χρήση στηλών (Μέθοδος 3).
 

Η τελευταία πρόκληση είναι να έχουμε διεθνώς αναγνωρισμένα, επικυρωμένα και αναπαραγώγιμα υλικά αναφοράς, ιδίως για τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Το OLEUM πραγματοποιεί μια διαδικασία επικύρωσης αξιολογώντας την ένταση και τη χρησιμότητα δύο υλικών αναφοράς: ένα υλικό για τον εντοπισμό του κρασώδου/ξιδάτου ελαττώματος και ένα για το ελάττωμα του ταγγίσματος (Μέθοδος 4Γ).
 

Εικ. 1 Πιθανή χρήση μιας στοχευμένης ενόργανης προσέγγισης ως εργαλείο επιβεβαίωσης/απόρριψης της οργανοληπτικής αξιολόγησης (Πάνελ Τεστ)

Abschlusskonferenz des OLEUM-Projekts: Merken Sie sich den Termin vor!

Das OLEUM-Projekt nähert sich schnell seinem Ende und ist bereit, seine fruchtbaren Ergebnisse zu liefern. Die OLEUM-Abschlusskonferenz – „Bessere Lösungen zum Schutz der Qualität und Authentizität von Olivenöl" – findet als Online-Veranstaltung am 17. und 18. Februar 2021 zwischen 14:00 und 17:00 Uhr MEZ statt. Merken Sie sich diesen Termin also bitte schon mal in Ihrem Kalender vor.
 

Das generelle Ziel des OLEUM-Projekts ist es, die Qualität und Authentizität von Olivenöl besser zu gewährleisten, indem die Erkennung von Betrug unterstützt und die Prävention davon gefördert wird. Während der Konferenz wird OLEUM in all seinen wesentlichen Aspekten vorgestellt:
 

• die neuen und überarbeiteten validierten Methoden zur Kontrolle der Qualität und Authentizität von Olivenöl,
• die OLEUM-Datenbank - ein IT-Instrument für Konformitätskontrollen im Olivenölsektor,
• die Nachhaltigkeit des OLEUM-Netzwerks.

Die Abschlusskonferenz wird mit einer Präsentation zu den politischen Entwicklungen in der EU zusammen mit dem IOC-Follow-up der validierten Methode eröffnet. Dabei werden zukünftige Betrugsbekämpfungsmaßnahmen unter Einbeziehung vieler Interessengruppen kritisch diskutiert.

Klicken Sie auf den Link, um sich für diese zweitägige Veranstaltung zu registrieren: https://us02web.zoom.us/webinar/register/WN_ltBgGLzrSjG_6ISt_TfoYA
 

Programm der Abschlusskonferenz: http://www.oleumproject.eu/news/article/oleum-final-conference
 

Folgen Sie OLEUM auf Twitter (https://twitter.com/oleum_eu?lang=en) für weitere Aktualisierungen oder besuchen Sie die Projektwebsite von OLEUM (http://www.oleumproject.eu/).
 

Für weitere Informationen senden Sie uns bitte eine E-Mail an oleum@unibo.it.

Methode M4C

Sensorische Analyse von nativem Olivenöl unter Verwendung von künstlichen Referenzmaterialien

Die M4C-Methode wurde entwickelt, um die IOC-Methode für die organoleptische Bewertung der VOOs durch den Einsatz neuartiger, künstlicher, wiederholbarer und stabiler Referenzmaterialien (RMs) zu verbessern, die ad hoc hergestellt werden, um dem Aroma der sensorischen Defekten zu ähneln, und die für die Kalibrierung der sensorischen Panels verwendet werden sollen (entsprechend den Angaben im „Leitfaden für die Auswahl, Ausbildung und Qualitätskontrolle von Verkostern von nativen Olivenölen - Qualifikationen von Verkostern, Panelleitern und Ausbildern"). Das Standardarbeitsverfahren (SOP) für diese Methode hat sich auf die Sammlung von Rückmeldungen über die Durchführbarkeit des Einsatzes dieser beiden RMs konzentriert, als Unterstützung bei der Identifizierung und Bewertung von nach Wein riechenden und ranzigen Mängeln in VOOs sowie auf das Aufzeigen eventueller Probleme und kritischer Punkte, die zur weiteren Verbesserung der RMs beitragen können.
 

Die Ziele des Vorverfahrens für M4C waren drei:

i) Bewertung der Repräsentanz der Referenzmaterialien (RM1 und RM2) im Hinblick auf eine Beurteilung durch die Teilnehmer hinsichtlich ihrer Nützlichkeit der Ähnlichkeit des Aromas mit natürlichen sensorischen Mängeln von essigsaurem Geschmack und Ranzigkeit (ausgedrückt als Prozentwerte, wobei für jeden Prüfer zwei Antwortmöglichkeiten, nämlich nützlich/nicht nützlich, zur Verfügung stehen);

ii) um die wahrgenommenen Intensitäten der Mängel in Bezug auf essigsaurem Geschmack und Ranzigkeit für RM1 bzw. RM2 zu berechnen; dies wurde durchgeführt, da die Definition der Intensität jedes sensorischen RM eine grundlegende Information darstellt, um seine mögliche zukünftige Verwendung bei der Ausbildung der Prüfer und der Panelkontrolle im Laufe der Zeit zu ermöglichen;

iii) zwei „echte“ Proben von nativem Olivenöl auf ihre sensorischen Eigenschaften hin zu beurteilen, um sie im folgenden Schritt des eigentlichen Versuchs als sensorisch kennzeichnende Proben (Trainingsproben) zu verwenden; im eigentlichen Versuch werden diese beiden kennzeichnenden Proben den Prüfern zur erneuten Analyse unter gemeinsamer Verwendung der beiden RMs vorgelegt, um festzustellen, ob die Bereitstellung dieser spezifischen Referenzstandards die Erkennung der Eigenschaften von essigsaurem Geschmack und Ranzigkeit in den Proben erleichtern kann, und um ihre Intensität zu quantifizieren.

Zehn öffentliche/private Laboratorien, die über ein geschultes sensorisches Panel für die Analyse von Olivenöl verfügen, welches von nationalen/internationalen Kontrollstellen anerkannt ist, nahmen am Vorversuch teil. Diese setzten sich zusammen aus den folgenden Teilnehmern: 3 aus Italien, 3 aus Spanien, 2 aus Deutschland, 1 aus den USA und 1 aus Australien. Die Teilnehmer haben zwei verschiedene Proben von nativem Olivenöl sowie die beiden RMs erhalten und wurden in Bezug darauf gebeten, diese nach der von den Methodenentwicklern erstellten SOP zu analysieren. Die Teilnehmer hatten zudem die Möglichkeit, an einem Workshop zum Fachwissensaustausch in Bologna im Dezember 2019 teilzunehmen. Bei diesem Workshop konnten sie Fragen stellten und Feedback zur Anwendung des Analyseprotokolls und insbesondere zu den Informationen der SOP geben. Die teilnehmenden Laboratorien meldeten keine Probleme oder Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der SOP. Daher wurden keine Änderungen an diesem Dokument vorgenommen.

Die hohe Anzahl positiver Feedbacks der Panels bezüglich der Repräsentanz der RMs deutete auf eine Übereinstimmung in der Ähnlichkeit mit den natürlichen Aromen hin. Unter Berücksichtigung dieser Feedbacks, die von den teilnehmenden Laboratorien für die Analyse der RMs gegeben wurden, sowie der erzielten Ergebnisse in Bezug auf die Medianwerte der Intensitäten beschlossen UNIBO und CSIC jedoch, Mischungen von RMs, die stärker verdünnt sind als die während des Vorversuchs verwendeten, für den eigentlichen Versuch auszuwählen und vorzubereiten (nur nach dem Geruch).

Für die Alma Mater Studiorum - Universität Bologna (UNIBO): Prof. Alessandra Bendini

Für das Instituto de la Grasa (CSIC): Dr. Diego Luis García González