Soluciones analíticas de OLEUM para la autenticidad del aceite de oliva.
La Dra. Alessandra Bendini, en el marco de la Sesión de Fraude Alimentario - Parte I: Autenticidad e Integridad, organizada durante el Congreso EFFOST de 2018, pronunció un discurso sobre los avances del Proyecto OLEUM dirigido a posibles soluciones analíticas para la autenticidad del aceite de oliva.
Considerando la necesidad de combatir las prácticas comerciales fraudulentas que perjudican al sector del aceite de oliva reduciendo la confianza de los consumidores y la imagen positiva de los productos oleícolas, el Proyecto OLEUM desempeña un papel importante. Específicamente, OLEUM tiene como objetivo desarrollar y validar soluciones analíticas fiables como:
i) revisiones de los métodos oficiales de la UE existentes que sugieren el reemplazo de pasos específicos de los protocolos analíticos para reducir el tiempo de análisis y el consumo de disolventes.
ii) nuevos métodos para detectar marcadores específicos para fraudes concretos mediante enfoques dirigidos (targeted).
iii) nuevos métodos de cribado mediante procedimientos no dirigidos (non targeted).
En este marco, se han presentado algunos ejemplos de nuevas estrategias analíticas para detectar los tres casos más comunes de fraude de aceite de oliva.
En particular, el primer caso se refiere a la calidad no acorde al grado declarado, por ejemplo, cuando un aceite virgen o, en el peor de los casos, un aceite de oliva lampante, se comercializa como aceite de oliva virgen extra (AOVE), que es el grado de calidad superior: se ha desarrollado un método dirigido para apoyar la prueba del Panel del COI (método sensorial oficial) basado en la identificación y cuantificación de moléculas volátiles individuales como marcadores de defectos sensoriales, y su validación está en curso (socios involucrados: CSIC, ITERG, NESTEC, UB, UNIBO, UNIPG, UNIUD). Este enfoque SPME-GC-FID/MS debe ser capaz de discriminar las muestras según sus grados de calidad y debe ser lo suficientemente simple como para ser aplicado por los laboratorios oficiales de control. No existe aún un método oficial similar. Además, teniendo en cuenta la necesidad de disminuir significativamente el trabajo diario de los paneles sensoriales de las Empresas oleícolas, se están evaluando cuatro métodos diferentes de cribado rápido no dirigidos (socios involucrados: EUROFINS, UB, UNIBO). Estos métodos se basan en un enfoque de características especiales que implica una elaboración quimiométrica de los perfiles completos en moléculas volátiles sin pasos de identificación y cuantificación. El objetivo es construir modelos de clasificación robustos capaces de discriminar muestras según sus grados de calidad. En este punto, los modelos de clasificación se han realizado con 180 aceites escogidos durante el muestreo del primer año (socios involucrados: EUROFINS, ITERG, IPTPO, UNIBO, UZZK, ZRS). Los resultados preliminares muestran porcentajes superiores al 85% de clasificación correcta de los AOVE y los que no lo son. Al considerar los no-AOVE, se encontraron porcentajes similares al distinguir entre los aceites de oliva vírgenes y los lampantes. Estos modelos de clasificación se reforzarán gracias a la adición de las otras 154 muestras seleccionadas durante el muestreo del segundo año (socios involucrados: EUROFINS, ITERG, IPTPO, UNIBO, UZZK, ZRS).
Según el Reglamento de la UE, los aceites de oliva vírgenes deben obtenerse de las aceitunas únicamente mediante tratamientos mecánicos o físicos bajo condiciones que no conduzcan a la alteración del aceite. Por este motivo, el tratamiento de desodorización suave es una práctica ilegal cuando se realiza con el objetivo de disminuir los compuestos volátiles responsables de los atributos negativos y, de este modo, eliminar los defectos sensoriales de los aceites de oliva de baja calidad. Este aceite de suave desodorizado luego se mezcla con un porcentaje de AOVE y la mezcla se comercializa de manera fraudulenta como AOVE. Sin embargo, la desodorización suave, que se realiza a baja temperatura, no elimina los ésteres etílicos de ácidos grasos (FAEE) que permanecen en el aceite. Este aceite desodorizado suave luego se mezcla con un porcentaje de AOVE y la mezcla se comercializa de manera fraudulenta como AOVE. Sin embargo, la desodorización suave, que se realiza a baja temperatura, no elimina los ésteres etílicos de ácidos grasos (FAEE) que permanecen en el aceite. Los FAEE se forman en las aceitunas almacenadas por la reacción entre los ácidos grasos libres producidos por la hidrólisis enzimática de los triacilgliceroles (TGs) y el etanol producido por la fermentación microbiana del azúcar. Por este motivo, los FAEE son marcadores de baja calidad de los aceites y pueden considerarse, también, marcadores indirectos de tratamiento de desodorización suave. Sobre esta base, en 2011 se aprobó un método oficial para establecer la concentración de los FAEE y el límite legal para el AOVE se modificó posteriormente. Sin embargo, el método oficial es particularmente laborioso, consume mucho tiempo y requiere grandes volúmenes de disolventes. En vista de estos inconvenientes, en los proyectos OLEUM se han realizado y validado internamente dos procedimientos alternativos para acelerar y mecanizar la recolección de los FAEE con el objetivo de proponer mejoras al protocolo oficial (por parte del CSIC y la UNIBO). En el Proyecto OLEUM se aplicó un tratamiento de desodorización suave por destilación de corto recorrido a diferentes tipos de aceites de oliva vírgenes defectuosos (por el ITERG). Después de esto, se prepararon diferentes mezclas entre cada aceite desodorizado suave y AOVE en diferentes proporciones (por el FERA) y se analizaron. Sobre la base de este tipo de conjunto de muestras, los socios de OLEUM están trabajando para establecer nuevas estrategias de análisis analítico para verificar la conformidad de los AOVE con el límite legal de los FAEE (socios involucrados: CSIC, ITERG, UNIBO), pero también para detectar posibles nuevos marcadores de este tratamiento ilegal; específicamente, se han propuesto preliminarmente nuevos parámetros legales basados en ácidos grasos libres y diacilgliceroles (DG) y la efectividad de los mismos está siendo evaluada (por el CSIC).
El segundo caso de fraude común se refiere a la mezcla ilegal y legal entre el aceite de oliva virgen extra o el aceite de oliva y otros aceites vegetales más baratos. Según el Reglamento de la UE 29/2012, es posible producir y comercializar en los países de la UE (con algunas excepciones nacionales como en España e Italia) mezclas legales entre aceite de oliva (AO) y aceites vegetales. En este caso, la presencia de aceite de oliva se puede reflejar en la etiqueta solo si representa más del 50% de la mezcla. Sin embargo, todavía no existe un método oficial para verificar la autenticidad de esta declaración. Para combatir este posible fraude, en el Proyecto OLEUM los investigadores están configurando un método dirigido para ser aplicado por los laboratorios oficiales de control (por el CSIC). Este nuevo método se basa en la elaboración de un árbol de decisión que fija los contenidos mínimos de los compuestos mayoritarios (TG) y minoritarios típicos (hidrocarburos alifáticos lineales, tocoferoles, esteroles libres) del AO y AOVE.
Para detectar aceites extraños en el aceite de oliva virgen extra y el aceite de oliva, el método oficial calcula un parámetro específico denominado ECN 42. Este límite legal se basa en un cálculo matemático y el protocolo analítico es laborioso (largo tiempo de análisis, uso de gran cantidad de disolventes) y presenta algunas limitaciones (baja resolución de TGs específicos). Un enfoque analítico alternativo, específicamente un método de detección rápida, está siendo estudiado en el Proyecto OLEUM (por la UB). Este enfoque analítico presenta muchas ventajas en comparación con el oficial. De hecho, el instrumento, basado en HESI-UHRMS, funciona con alto poder de resolución y precisión y el análisis por infusión directa es muy rápido (solo se requieren 2 minutos para cada análisis), y la preparación de la muestra es simple. Es decir, diferentes tipos de posibles adulterantes de AOVE o AO han sido considerados y divididos en aceites vegetales caracterizados por i) alto contenido en ácido oleico como avellana, aguacate y aceite de girasol alto oleico, tanto vírgenes como refinadas ii) alto adulterante linoleico como aceite de girasol refinado convencional y iii) alto adulterante palmítico como aceite de palma refinado. Para cada adulterante se prepararon tres porcentajes diferentes (2, 5 y 10%) en AOVE y AO. Para este enfoque, el tratamiento de datos quimiométricos, en el que se utiliza el perfil de TG como matriz de datos, es esencial. Los resultados obtenidos para los modelos alto palmítico y alto linoleico, en los que los adulterantes fueron el aceite de palma refinado y el aceite de girasol refinado, respectivamente mezclados al 2, 5 y 10% en AOVE y AO, fueron satisfactorios; de hecho, todas las muestras adulteradas y las no adulteradas se clasificaron correctamente. Teniendo en cuenta el caso más difícil, relacionado con el modelo con alto contenido en ácido oleico, en el que los adulterantes eran los aceites refinados y vírgenes de avellana, los aceites refinados y vírgenes de aguacate y los aceites refinados y desesterolizados de girasol con alto contenido oleico, el modelo de predicción resultó satisfactorio solo cuando el adulterante estaba mezclado en AOVE o AO al 5 y 10%, excluyendo el nivel del 2%.
El tercer caso de fraude común se refiere a la no coincidencia con la designación de origen geográfico. En general, el comportamiento de los consumidores cuando compran alimentos está orientado hacia una mayor preferencia por aquellos productos cuyo origen geográfico se declara, ya que esta información claramente aumenta su confianza. Según el Reglamento de la UE 29/2012, el AOVE y el AOV deben llevar la denominación geográfica de origen en la etiqueta, siguiendo los casos específicos relacionados con el origen dentro de la UE o fuera de la UE y la procedencia de más de un Estado miembro o de un tercer país. A pesar de esto, no existe un método oficial (compartido y validado) para verificar la coincidencia con el origen geográfico que, hasta ahora, solo puede verificarse por trazabilidad documentada. La necesidad de disponer de un método fiable y rápido en la práctica, capaz de verificar el origen geográfico de un aceite de oliva virgen, es un requisito urgente. En el Proyecto OLEUM se están estudiando varios enfoques analíticos basados en análisis espectroscópicos y cromatográficos (socios involucrados: CONICET-EHU, CNRIFFI, EAF, EUROFINS, FERA, ITERG, SMART ASSAYS, UB, UNIBO, UNIPG, UNIUD). Uno de los métodos más prometedores evalúa la fracción semivolátil de hidrocarburos sesquiterpenos como marcadores de origen geográfico y los determina mediante un instrumento SPME-GC-MS con un enfoque tanto dirigido como no dirigido (por la UB). El enfoque no dirigido, que elabora como una huella digital todo el perfil semivolátil, permite una discriminación mucho mejor que el método dirigido. Además, el método se puede proponer para análisis rutinarios porque este tipo de instrumento generalmente está disponible en los laboratorios de control. También se ha desarrollado otro enfoque analítico innovador para el análisis de los compuestos volátiles del espacio de cabeza de los aceites de oliva vírgenes y se basa en el análisis por Cromatografía de Gases Flash (por la UNIBO). La principal ventaja de esta técnica es el corto tiempo de análisis, de hecho, solo se necesitan 3 minutos para realizar el perfil de los compuestos volátiles. Se ha realizado una elaboración quimiométrica aplicada con un enfoque no dirigido a las trazas cromatográficas. Hasta ahora, el número de muestras analizadas con este método fue de 174, caracterizadas por su diferente origen geográfico: de países únicos de la UE, de países únicos no pertenecientes a la UE y mezclas de países de la UE y no pertenecientes a la UE. Los resultados de predicción obtenidos a partir del modelo de clasificación fueron satisfactorios, de hecho, la validación cruzada completa y la validación externa permitieron una clasificación correcta del 98,5 y 92,5% para muestras no pertenecientes a la UE, respectivamente, y 5 de las 6 de las mezclas fuera de la UE se clasificaron correctamente. Teniendo en cuenta el conjunto más amplio de aceites de la UE, la validación cruzada completa y la validación externa permitieron clasificar correctamente el 86 y el 80% de las muestras, respectivamente, y 9 de las 12 mezclas de la UE también se clasificaron correctamente. Se deben analizar otras muestras para verificar los resultados satisfactorios obtenidos, en particular será necesario agregar muestras que no pertenezcan a la UE para equilibrar mejor los dos conjuntos de muestras.
Alessandra Bendini (Università di Bologna, UNIBO), Stefania Vichi y Alba Tres (Universitat de Barcelona, UB), Wenceslao Moreda y Diego Luis García-González (Instituto de la Grasa, CSIC)