Método M1
Determinación del contenido total de hidroxitirosol y tirosol en el aceite de oliva, desde el punto de vista de sus beneficios saludables, mediante UHPLC
El método M1 fue desarrollado dentro de la tarea “Aumentando la confianza del consumidor en las propiedades saludables del aceite de oliva virgen extra: desarrollo de métodos para determinar los compuestos fenólicos” en determinación mediante UHPLC del contenido total de hidroxitirosol (Htyr) y tirosol (Tyr) en el aceite de oliva, desde el punto de vista de sus propiedades saludables, presentado por la regulación EC 432/2012 para “polifenoles de aceite de oliva”. Este método tiene como objetivo cuantificar el contenido total de Htyr y Tyr en la fracción polar del aceite de oliva, seguido de la hidrólisis ácida de sus formas ligadas. Este contenido puede cuantificarse de forma precisa utilizando estándares disponibles comercialmente, y es expresado como Htyr total y Tyr (mg/20 g de aceite) después de la corrección de las diferencias de peso molecular entre las formas libres y ligadas. La UHPLC ha sido utilizada para acelerar el análisis (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(6), 1044; https://doi.org/10.3390/molecules24061044).
El método M1, que está gráficamente representado en la Fig. 1, ha sido validado internamente en términos de especificidad, linealidad, precisión, recuperación y robustez, incluyendo la determinación de los LOD y LOQ de los analitos. El procedimiento de extracción no fue validado, como lo fue el propuesto por IOC (COI/T.20/Doc. No. 29, 2009) sin la adición del estándar interno.
Fig. 1 Protocolo UHPLC validado internamente según el propósito de beneficios para la salud de Htyr y Tyr en aceite de oliva
Los resultados del método M1 han sido comparados con los obtenidos según el método COI (Method COI/T.20/DOC. 29/Rev. 1 – 2017, Determinación de biofenoles en aceite de oliva por HPLC) como se mostró en una publicación reciente (Tsimidou et al., 2019, Molecules, 24(13), 2429; https://doi.org/10.3390/molecules24132429).
De acuerdo con procedimientos del proyecto OLEUM, el método M1 fue seleccionado para validación total, que es llevada a cabo en dos ciclos. Trece laboratorios de Europa, China, Estados Unidos y Australia participaron entre septiembre y diciembre de 2019 en el estudio preliminar. Los participantes recibieron dos muestras diferentes de aceite de oliva virgen extra para analizarlas según el procedimiento operativo estándar (SOP, por sus siglas en inglés) preparado por los desarrolladores del método. Los participantes también tuvieron la oportunidad de asistir a un taller de transferencia de conocimiento, en octubre de 2019, en Sevilla, en el cual hicieron preguntas y proporcionaron retroalimentación sobre la aplicación del protocolo analítico y la información del procedimiento operativo estándar en particular.
El análisis de meta datos de los cromatogramas y los respectivos resultados cuantitativos identificaron la etapa de la hidrólisis como crítica si no se seguían las condiciones exactas descritas en el procedimiento operativo estándar. Los puntos débiles que surgieron en el estudio preliminar fueron abordados en la versión revisada del procedimiento operativo estándar enviado a los participantes del ensayo. Además, un audio-video del método M1 que incluye explicaciones sobre cálculos con ejemplos, que también fue producido por los desarrolladores, está disponible en YouTube (https://www.youtube.com/watch?v=-nr45PnLnF4) a través de OLEUM, para facilitar el entrenamiento de los interesados. La validación formal del método se está llevando a cabo en la actualidad.
Por el equipo de desarrolladores M1 de la Universidad Aristóteles
Maria Z Tsimidou (Profesora) y Nikolaos Nenadis (Profesor Asistente)